重組人HER2蛋白的純化及抗HER2人源性抗體的初步篩選.pdf

1、中南大學(xué)碩士學(xué)位論文重組人HER2蛋白的純化及抗HER2人源性抗體的初步篩選姓名：劉孝榮申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：賀智敏20050501形式存在，但以不溶的包涵體形式為主。低溫(30℃)、較高的細(xì)菌密度(A600=18)、較低的IPTG濃度(005mM)和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基添加劑能有利于可溶性融合蛋白的表達(dá)，可溶性GST—HER2胞外段融合蛋白的產(chǎn)量約為015mg／L菌液；(2)GSTHER2胞外區(qū)復(fù)性條件為：在復(fù)性

2、緩沖液(25mMTris—C1，01MNaCl，10％甘油，lM尿素，001ML精氨酸，lml|還原型谷胱甘肽，O5mM氧化型谷胱甘肽，PB9O)中，4℃孵育24h復(fù)性效果較好，經(jīng)變性復(fù)性純化的融合蛋白產(chǎn)量可達(dá)L829mg／L菌液。經(jīng)PreScission蛋白酶切后，得到純化的重組HER2胞外區(qū)蛋白，其產(chǎn)量達(dá)1071mg／L菌液；(3)包涵體免疫新西蘭兔后，可產(chǎn)生針對HER2胞外區(qū)的效價(jià)達(dá)1：10000以上的多抗；(4)先期重組的輕鏈庫

3、的重組率為90％，實(shí)際庫容為113X106，后期重組的重鏈庫的重組率為90％，實(shí)際庫容為253X108，帶輕鏈和重鏈Fd段的Fab實(shí)際庫容量為228X1艫；(5)抗體庫經(jīng)富集篩選后，30個(gè)克隆中得到2個(gè)抗HER2胞外區(qū)的單克隆，陽性率為67％。結(jié)論：(1)低溫、較高的細(xì)菌密度和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基添加劑能有利于可溶性融合蛋白的表達(dá)。(2)GSTHER2ECD包涵體經(jīng)變性后，可在體外復(fù)性成功；(3)利用GSTHER2ECD包涵體蛋白制備的多克隆抗