人工寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病及其機制的實驗研究.pdf

1、第一部分人工寒潮時大鼠腦卒中發(fā)病的影響因素 背景和目的 自然寒潮由于受季節(jié)限制且每次寒潮的主要指標(biāo)很難一致，影響了結(jié)果的分析，為此我們改裝了RXZ-300A型智能人工氣候箱，按廣東省氣象局制定的寒潮標(biāo)準(zhǔn)(日平均氣溫在24小時內(nèi)急劇降溫≥8℃或48小時內(nèi)降溫≥10℃，而且過程中最低氣溫≤5℃)來實施人工寒潮，一次寒潮(22℃×24h-3℃×12h-22℃×24h)腎血管性高血壓大鼠(renovascularhyperten

2、siverats，RHR)的腦卒中發(fā)病率達16％，獲得較理想的結(jié)果。 然而，溫度變化對高血壓病相關(guān)疾病死亡的影響有明顯的滯后性和持續(xù)性，低溫的影響達到頂點的時間各個報道(24～54小時、6小時～5天、6～7天)不等。以往我們僅研究一天寒潮的影響未能真正反映臨床的實際情況，因此在本課題中我們在使用改造的人工氣候箱模擬自然寒潮的同時，延長寒潮時間，考慮到人們冬天留在溫暖室內(nèi)的時間也相當(dāng)長，常處于室內(nèi)外變動中，因此本研究還采用寒冷與室

3、溫交替的方法，以期更真實地反映日常生活中寒潮對人們的影響。 本研究的目的在于尋找盡可能真實模仿自然寒潮對于腦卒中發(fā)病影響的人工寒潮處理方法，以進一步利用此模型探討寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病的機制。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，還將RHR分成不同血壓水平，探討人工寒潮時不同血壓水平對腦卒中發(fā)病的影響，以了解不同水平的患病基礎(chǔ)上發(fā)病誘因所起的作用。 方法 應(yīng)用雙腎雙夾法復(fù)制RHR模型，術(shù)后12周形成穩(wěn)定高血壓后，正常血壓組與RHR組各分

4、為寒潮和非寒潮兩大組。寒潮組置于人工氣候箱中，溫度設(shè)置以22℃12小時，4℃12小時為1天循環(huán)，共3天。非寒潮組置于溫度22℃的人工氣候箱共3天。正常血壓大鼠寒潮和非寒潮組各30只，160mmHg～199mmHgRHR、200mmHg～219mmHgRHR、≥220mmHgRHR各50只。在人工氣候箱處理前后測量體重、血壓，以寒潮3天、出現(xiàn)偏癱癥狀或意識障礙、死亡為研究終點，在研究終點將大鼠斷頭取腦，先肉眼觀察出血情況，再用三苯唑氯化物

5、(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色觀察梗死情況，然后取連續(xù)石蠟切片，HE染色確定腦卒中情況。 結(jié)果 除160～199mmHg組外，正常大鼠與其余血壓亞組的RHR經(jīng)寒潮后體重均減輕，血壓越高者經(jīng)寒潮后體重減輕越明顯。正常鼠經(jīng)人工氣候箱處理(寒潮或非寒潮)后血壓均升高，160～199mmHgRHR經(jīng)人工氣候箱非寒潮處理后血壓也有所升高，RHR經(jīng)寒潮后血壓均較寒潮前降低，血壓較高(200～

6、219mmHg、≥220mmHg)者即使未經(jīng)寒潮血壓也較寒潮前降低。 寒潮組RHR的腦卒中發(fā)生率為29.3％，非寒潮組RHR的腦卒中發(fā)生率為17.3％，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。病灶分布在皮質(zhì)或皮質(zhì)下白質(zhì)的病灶占91.7％，以枕頂區(qū)多見，額葉未見病灶。 腦出血發(fā)生率明顯高于腦梗死、混合性中風(fēng)的發(fā)生率(P＜0.001)。血壓≥220mmHgRHR的寒潮組、非寒潮組之間的腦卒中發(fā)生率有顯著性差異(P＜0.05)，其余

7、各血壓亞組的寒潮組、非寒潮組之間的腦卒中發(fā)生率無顯著性差異。 無論寒潮或非寒潮組，血壓＜220mmHg與血壓≥220mmHgRHR的腦卒中發(fā)生率有顯著性差異(P＜0.001)。 將人工氣候箱處理前后體重、血壓以及是否經(jīng)人工氣候箱處理等5個自變量以ENTER法進入Logistic回歸，發(fā)現(xiàn)只有寒潮前血壓是腦卒中發(fā)生的唯一獨立危險因素(腦卒中發(fā)生=0.072×寒潮前血壓-12.725，P＜0.01)。 結(jié)論

8、1.寒潮雖非腦卒中的獨立危險因素，但在嚴(yán)重的腦血管病變(高血壓)的基礎(chǔ)上，也是一個重要的外部誘發(fā)因素。 2.本研究采用的人工寒潮方法能更好地模擬自然寒潮時臨床腦卒中的發(fā)病情況，對于進一步研究氣象因素促發(fā)腦卒中的機制以及預(yù)防有重要意義。由于高血壓越高及經(jīng)歷寒潮而尚未發(fā)生腦卒中的大鼠越接近卒中前狀態(tài)，加上人工寒潮易于控制、量化的特點，本研究采用的模型是適合卒中前狀態(tài)研究的理想模型之一。 第二部分人工寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病的機制研

9、究 背景和目的 本研究第一部分肯定了兩個事實：1)腦血管病變必須達到一定的嚴(yán)重程度才具備易卒中的條件；2)在嚴(yán)重的腦血管病變基礎(chǔ)上，在外部因素(寒潮)的作用下，更易于促發(fā)腦卒中。當(dāng)滿足其中一點而又尚未發(fā)生腦卒中時，機體所處的狀態(tài)均可被稱為卒中前狀態(tài)，其對于腦卒中預(yù)防是相當(dāng)重要的階段。研究卒中前狀態(tài)，第二點應(yīng)該更具代表性。第一點的相關(guān)研究已較多而全面，但關(guān)于第二點的研究比較缺乏，且存在一些問題。鑒于凝血、纖溶分子及細(xì)胞粘附

10、分子與腦卒中及其危險因素的密切關(guān)系，根據(jù)以往研究存在的問題及第一部分的研究結(jié)果，第二部分將重點研究：1)不同血壓水平對血漿凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor，TAFI)、蛋白C(proteinC，PC)、vWF、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombincomplexes，TAT)、纖溶酶-α2-抗纖溶酶(plasmin/α2-anti-pl

11、asmin，PAP)以及腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的影響；2)不同血壓水平下寒潮對以上指標(biāo)的影響。由于血壓越高，加上寒潮的影響，卒中發(fā)生率越高，因此高血壓越高及經(jīng)歷寒潮而尚未發(fā)生腦卒中的大鼠就越接近卒中前狀態(tài)，是本研究的重點，了解該狀態(tài)下內(nèi)皮功能的變化是國內(nèi)外的首次研究，對明確卒中前狀態(tài)的機制及進一步指導(dǎo)腦卒中預(yù)防有重要意義。另外，本研究還比較腦卒中與非卒中大鼠的上述指標(biāo)的不同，以了解腦卒中前、后內(nèi)皮功能的

12、改變。 方法 實驗動物分組方法同第一部分，各亞組12只大鼠。發(fā)生腦卒中者被剔出卒中前狀態(tài)的分析，另外補充處理大鼠，保證原位雜交及免疫組化每亞組各有6只無卒中大鼠。 靜脈取血抗凝，4℃離心，收集血漿，-80℃保存，ELISA或發(fā)色底物法檢測血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平。已取血的大鼠，灌注后斷頭取腦，由嘴側(cè)至尾側(cè)每2毫米切成一冠狀薄片，嘴側(cè)2毫米腦片置于凍存管中，-80℃保存，備做實時熒光定量RT-

13、PCR。取視交叉層面作以下處理：1)每亞組6只視交叉層面連續(xù)石蠟切片，每8張取1張切片作免疫組化檢測血管內(nèi)皮的vWF、ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的蛋白表達，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶；2)每亞組6只視交叉層面冰凍切片機連續(xù)切片，每8張取1張切片作原位雜交檢測血管內(nèi)皮的ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的mRNA表達，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶。視交叉層面以外其它腦片連續(xù)石蠟切片，HE染色，了解是否

14、有卒中病灶。結(jié)果1.剔除腦卒中的各血壓亞組大鼠經(jīng)人工氣候箱處理后血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管的vWF的mRNA表達(目的片段拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)，VWF/GAPDH)與蛋白表達、腦血管的VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達(比較原位雜交陽性信號及實時熒光定量RT-PCR，目的片段拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)，VCAM-1/GAPDH、ICAM-1/GAPDH、P-選擇素/GAPDH)與蛋白表達變

15、化趨勢一致如下： 1.1在＜220mmHg血壓組，寒潮組的血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達與蛋白表達比非寒潮組均有升高趨勢。在≥220mmHg血壓亞組，寒潮組的上述指標(biāo)比非寒潮組均有降低趨勢。 1.2在非寒潮組，血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達與蛋白表

16、達均隨血壓升高而升高。在寒潮組，上述指標(biāo)在血壓＜220mmHg時均隨血壓升高而升高，然而在血壓≥220mmHg時轉(zhuǎn)為降低。 2.腦卒中大鼠的血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平及腦血管內(nèi)皮粘附分子vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達、蛋白表達均與未發(fā)生卒中者不同，腦梗死與腦出血之間的上述各種指標(biāo)的表達也不同。 結(jié)論 1.非寒潮時腦血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達、凝血、纖溶功能隨血壓升