PTEN-FAK信號通路在幽門螺桿菌致病中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　胃癌是全球第4位常見的惡性腫瘤,也是第2位最常見的癌癥致死性疾病,其中近一半的胃癌患者分布于東亞,且主要在中國。胃癌的發(fā)生過程是一個多因素、多步驟的過程,而大量研究證實幽門螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。全球感染幽門螺桿菌的自然人群比率超過總?cè)丝跀?shù)的一半。世界衛(wèi)生組織已將幽門螺桿菌列為胃癌的I類致癌因子。但Hp致胃癌的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚。由于人們生活條件和診療水平的提高,胃癌發(fā)病率和死亡率較前幾年有所下降,

2、可確診時大多數(shù)患者已處晚期。因此,明確幽門螺桿菌的作用機(jī)制和胃癌的早期診斷對其治療后和預(yù)后有著十分關(guān)鍵和重要的意義。
　　PTEN是繼p53之后發(fā)現(xiàn)的最有價值的一種新的抑癌基因,功能的失活與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),因此,近年來相關(guān)的研究也成為一大熱點(diǎn)。PTEN基因編碼的蛋白質(zhì)具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶雙重活性,能通過磷酸酶功能介導(dǎo)多條信號通路發(fā)揮作用,但磷酸化后會致使其功能喪失,許多相關(guān)研究顯示蛋白的穩(wěn)定性較磷酸化之前卻明顯增加,進(jìn)而導(dǎo)致抑

3、癌功能的喪失,使腫瘤易感性明顯增加。PTEN蛋白可通過調(diào)控下游靶因子 FAK在細(xì)胞粘附、遷移、增值、凋亡、骨架調(diào)節(jié)和生長等方面發(fā)揮重要作用。經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),最近幾年P(guān)TEN/FAK信號通路在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起重要作用。目前認(rèn)為Hp感染常在胃癌中起著始發(fā)和先導(dǎo)作用,但如何通過PTEN/FAK信號通路影響胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確。為此,本課題將通過體內(nèi)、外研究探討PTEN/FAK信號通路在胃黏膜癌變過程中作用及其與Hp

4、感染的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1.采用免疫組化方法來檢測人體胃黏膜標(biāo)本的慢性非萎縮性胃炎( chronic non-atrophic gastritis,CNAG,40例)、腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM,40例)、異型增生(dysplasia,Dys,40例)和胃癌(gastric cancer,GC,45例)中PTEN、p-PTEN、FAK和p-FAK蛋白的表達(dá)。
　　2.采用免疫

5、組化方法分別檢測,在6月和12月ATCC43504 Hp菌株感染的蒙古沙鼠(60只)和以布氏肉湯灌胃的蒙古沙鼠(30只)中PTEN、p-PTEN、FAK和p-FAK的表達(dá)。
　　3.行Western blot分別檢測ATCC43504 Hp菌株作用GES-1細(xì)胞0、0.5h、1h、3h、6h和12h(MOI=50:1)后,PTEN/FAK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　4.構(gòu)建高表達(dá)PTEN蛋白的不同胃黏膜上皮細(xì)胞株,再以AT

6、CC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以 MOI=50作用高表達(dá)各目的基因的胃黏膜細(xì)胞,以同體積細(xì)胞培養(yǎng)液作為對照組,共培養(yǎng)1h后行Western blot檢測PTEN、p-PTEN、FAK和p-FAK蛋白的表達(dá)情況。
　　5.通過Transwell試驗觀察細(xì)胞的侵襲情況并計數(shù),我們用ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以MOI=100作用高表達(dá)各目的基因的胃黏膜細(xì)胞株,同時以同體積低血清細(xì)胞培養(yǎng)液作為對照組,分別作用20h。
　　結(jié)果:

7、
　　1.人胃黏膜癌變過程中PTEN、p-PTEN、FAK和p-FAK的表達(dá)情況及其與Hp感染的關(guān)系
　　(1)免疫組化結(jié)果顯示PTEN表達(dá)水平在CNAG最高,隨胃黏膜病變進(jìn)展而逐漸降低,在GC表達(dá)最低,其中IM分別與CNAG和Dys組間無顯著性差異(p>0.05),其余各病變階段間表達(dá)有顯著性差異。p-PTEN表達(dá)水平在CNAG最低,隨胃黏膜病變進(jìn)展而逐漸升高,在IM表達(dá)最高,在Dys和GC均有較高水平表達(dá),其中GC與CN

8、AG、IM和Dys間均無顯著性差異(p>0.05),其余各病變階段間有顯著性差異。
　　我們按Hp陽性和陰性將所有標(biāo)本均分兩組,分別比較各病變階段間的變化。在Hp陽性組的各病變階段PTEN蛋白表達(dá)趨勢呈現(xiàn)上述類似的結(jié)果(p<0.001);在Hp陰性組,GC分別與CNAG和Dys間有顯著性差異(p<0.05)。同時,p-PTEN表達(dá)在 Hp陰性組各病變階段亦呈現(xiàn)出類似結(jié)果(p<0.001),而在 Hp陽性組p-PTEN均有較高水平表

9、達(dá),但各病變階段之間的表達(dá)差異無意義(p>0.05)。
　　(2)FAK主要定位于胞漿,其表達(dá)水平在CNAG組和IM均較低,在后兩組表達(dá)均較高,在CNAG分別與Dys、GC有顯著性差異(p<0.05)。p-FAK表達(dá)水平在CNAG最低,隨胃黏膜病變進(jìn)展而逐漸升高,在IM表達(dá)最高,在Dys和GC組均有較高水平表達(dá);在Dys分別與IM、GC間無顯著性差異,其余各病變階段間有明顯的差異(p<0.05)。
　　如上所述,按Hp陽性和

10、陰性分兩組,在Hp陰性組CNAG與GC組間FAK蛋白的表達(dá)有顯著性差異(p<0.05);而 Hp陽性組各病變階段 FAK蛋白均有較高水平表達(dá),無顯著性差異(p>0.05)。Hp陽性組和陰性組p-FAK蛋白表達(dá)CNAG均與其他三組間有明顯的差異(p<0.05)。
　　(3)按組織標(biāo)本各病變階段的不同,各自分為 Hp陽性和陰性兩組進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃黏膜病變各階段,Hp陽性和陰性組間PTEN蛋白表達(dá)均無明顯的差異(p>0.05);而

11、在CNAG階段p-PTEN表達(dá)水平在Hp陽性組高于陰性組(p<0.05),在其余三個階段Hp陽性和陰性組間無顯著性差異(p>0.05)。在 CNAG、IM和 Dys階段,FAK和 p-FAK蛋白表達(dá)兩組間無顯著性差異(p>0.05)。在GC階段,FAK蛋白表達(dá)在Hp陽性組明顯低于陰性組(p<0.05),但p-FAK蛋白表達(dá)無顯著性差異(p>0.05)。
　　2.在蒙古沙鼠中Hp感染對PTEN和FAK蛋白的影響
　　(1)比較

12、蒙古沙鼠6月和12月的實驗組間差異,結(jié)果顯示PTEN蛋白的表達(dá)水平均無顯著性意義(p>0.05),且對照組間也無明顯差異(p>0.05)。而在12月Hp實驗組與對照組中p-PTEN蛋白的表達(dá)均顯著高于6月組(p<0.001)。分別比較實驗組和對照組的差異,6月和12月兩組中PTEN蛋白的表達(dá)均無顯著性差異(p>0.05);6月組p-PTEN蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(p>0.05),而12月組中Hp感染組p-PTEN表達(dá)水平顯著高于對照組

13、(p<0.001)。
　　(2)比較蒙古沙鼠6月和12月的實驗組間差異,發(fā)現(xiàn)12月組FAK蛋白的表達(dá)水平顯著高于6月組(p<0.001),且對照組間也存在明顯差異(p=0.001);而實驗組中12月p-FAK表達(dá)水平顯著高于6月(p<0.01),而對照組中12月組與6月組無明顯差異(p>0.05)。分別比較實驗組和對照組的差異,在6月和12月組FAK蛋白的表達(dá)水平均無明顯差異(p>0.05);6月組中p-FAK表達(dá)水平無顯著性差異

14、(p>0.05),而12月組中Hp感染組顯著高于對照組(p<0.05)。
　　3. Hp作用GES-1后對PTEN/FAK信號通路的影響
　　Hp活菌按50:1的濃度作用于GES-1細(xì)胞不同時間后,Western blot檢測PTEN和FAK表達(dá)在各時間點(diǎn)均無明顯變化(p>0.05),同時p-PTEN蛋白表達(dá)水平在各時間點(diǎn)均明顯升高,早期就開始升高(0.5h,p<0.001),1h達(dá)到高峰;p-FAK表達(dá)水平在作用后0.5h

15、即升高,隨時間的延長表達(dá)均明顯的增強(qiáng),3h達(dá)到高峰,12h內(nèi)均高于0h(p<0.001)。而對照組PTEN、p-PTEN、FAK、p-FAK表達(dá)均無明顯變化(p>0.05)。
　　4. PTEN在Hp活菌激活胃黏膜上皮細(xì)胞株P(guān)TEN/FAK信號通路中的作用
　　(1)Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株按50:1的濃度分別作用于 GES-1細(xì)胞、GES-1-Empty細(xì)胞、GES-1-PTEN-WT細(xì)胞和GES-1-PTEN-MT細(xì)胞1h后,PTE

16、N表達(dá)均無明顯變化(p>0.05),而p-PTEN表達(dá)水平在對照組中GES-1和GES-1-Empty, GES-1-PTEN-WT和GES-1-PTEN-MT均無明顯差異(p>0.05)。而與對照組相比,在GES-1、GES-1-Empty、GES-1-PTEN-WT和GES-1-PTEN-MT均明顯的升高(p<0.001、p<0.001、p=0.001和p<0.05)。
　　(2) Hp活菌按50:1的濃度分別作用于 GES-

17、1、GES-1-Empty、GES-1-PTEN-WT和GES-1-PTEN-MT1h后,FAK表達(dá)均無明顯變化(p>0.05),而p-FAK與對照組相比,在GES-1、GES-1-Empty和GES-1-PTEN-WT均明顯的升高(p<0.001、p<0.001和 p<0.05),而 GES-1-PTEN-MT則無明顯變化(p>0.05),且在GES-1-PTEN-WT明顯低于GES-1(p<0.05)。
　　5. Hp活菌通過

18、PTEN/FAK信號通路對胃黏膜上皮細(xì)胞株侵襲性的影響Hp活菌按100:1的濃度分別作用于 GES-1細(xì)胞、GES-1-Empty細(xì)胞、GES-1-PTEN-WT細(xì)胞和GES-1-PTEN-MT細(xì)胞20h后,檢測侵襲的細(xì)胞個數(shù)。與對照組相比,Hp作用后四組細(xì)胞的侵襲遷移個數(shù)均顯著的增加(p<0.05);在對照組中, GES-1-PTEN-WT細(xì)胞數(shù)顯著少于 GES-1( p<0.001),而GES-1-PTEN-MT顯著的增加(p<0.