幽門螺桿菌cag致病島cagS基因功能的研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是人類消化道疾病、特別是胃部疾病最主要的致病菌之一，為革蘭陰性螺旋形微需氧菌，其長期定植于人類胃粘膜，世界范圍內(nèi)的感染率達(dá)已達(dá)到50％?，F(xiàn)已證實，諸如消化性潰瘍、慢性胃炎、胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤甚至胃癌等多種胃腸道疾病的發(fā)生皆與H.pylori感染密切相關(guān)。Ⅰ型H.pylori菌株因攜帶cag致病島(cag pathogenicityisland，ca

2、g PAI)而致其毒性較強(qiáng)。H.pylori重要的毒力因子:細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A，CagA)由cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其功能紊亂。研究至今，已經(jīng)可以確定cag致病島中含有27個基因，并且世界范圍內(nèi)的專家學(xué)者們對其進(jìn)行了全面的探索研究，但時至今日仍有大部分基因與其編碼的蛋白質(zhì)的功能及其致病機(jī)理尚未完全明確。本文以cag致病島中的cagS基因作為研究對象，

3、通過微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)探討其功能，為進(jìn)一步研究cag致病島的致病機(jī)制和功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.H.pylori26695全基因序列來自于Genbank，經(jīng)生物信息學(xué)軟件:SignalP4.1 server對其信號肽進(jìn)行預(yù)測分析，使用Primer Premier6.0設(shè)計去信號肽后的cagS基因引物，并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-cagS，轉(zhuǎn)化入表達(dá)工程菌Rosetta(DE3);經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

4、后，確定蛋白可溶性，大量誘導(dǎo)后，使用QIAGEN系統(tǒng)Ni2+-NTA柱純化目的蛋白。并進(jìn)一步通過復(fù)性濃縮，獲得具有蛋白功能的CagS融合蛋白。使用SDS-PAGE電泳、Western blot等技術(shù)分析和鑒定目的蛋白。
　　2.將純化后的CagS融合蛋白免疫小鼠，制得鼠抗CagS多克隆抗血清，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定抗血清效價。
　　3.利用同源重組原理，設(shè)計PCR引物并擴(kuò)增cagS基因上下游同源臂片段，構(gòu)建cagS基因缺陷

5、自殺質(zhì)粒pBlueM40-△cagS::kan，通過電轉(zhuǎn)化使其進(jìn)入H.pyloriNCTC26695中，通過抗性篩選出陽性克隆，并使用PCR方法、基因測序方法以及Western blot分析驗證后，即獲得cagS基因缺陷株，并以野生株為對照，對其生長情況與尿素酶的分泌功能進(jìn)行檢測。
　　4.收集并裂解菌體，采用超高速低溫離心法進(jìn)行亞細(xì)胞分離，包括膜蛋白（包括內(nèi)膜和外膜）、胞質(zhì)蛋白及周質(zhì)間隙蛋白，利用Western Blot技術(shù)，以

6、鼠抗CagS多克隆抗血清為一抗，檢測CagS蛋白亞細(xì)胞定位。
　　5.將cagS基因缺陷株與NCTC26695野生株分別與胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后，分別提取細(xì)胞與細(xì)菌mRNA，對細(xì)胞IL-8以及細(xì)菌cagA的表達(dá)量進(jìn)行檢測;提取細(xì)胞蛋白，檢測CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)量，研究cagS基因缺陷對CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響;收集培養(yǎng)液上清，對細(xì)胞的IL-8分泌量進(jìn)行檢測。
　　6.收集cagS基因缺陷株與NCTC26695野生株，裂解后得

7、到細(xì)菌全菌蛋白，使用Western blot方法分別檢測cag致病島重要編碼蛋白Cagξ、CagX、CagM、CagL和CagI的表達(dá)量，研究cagS基因的缺失是否會對這些蛋白的合成與穩(wěn)產(chǎn)生影響。
　　7.利用細(xì)菌雙雜交體系，尋找cag致病島中與cagS基因有相互作用的可疑基因。
　　結(jié)果:
　　1.H.pylori NCTC26695菌株cagS基因全長為591bp，其相對分子質(zhì)量約為21kDa。預(yù)測該蛋白存在信號肽

8、，位置在N端的前21個堿基，在21至22的位置處斷裂。
　　2.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-cagS，通過原核表達(dá)，獲得大量目的蛋白CagS。并通過QIAGEN系統(tǒng)純化目的蛋白并免疫小鼠并制備鼠抗CagS多克隆抗血清，效價為1∶51200。
　　3.成功構(gòu)建cagS基因敲除重組自殺質(zhì)粒:pBlueKM40-△cagS::kan。通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)使自殺質(zhì)粒進(jìn)入H.pylori NCTC26695菌體內(nèi)，并利用卡那霉素抗性

9、篩選出同源重組成功的菌株，即為H.pylori cagS基因缺陷株:△cagS。通過酶切驗證、PCR以及對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序的方法進(jìn)行了驗證。
　　4.以鼠抗cagS多克隆抗血清為一抗作Western blot分析，確定CagS位于菌體膜部分;H.pylori與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測cagA mRNA表達(dá)量與CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)量，結(jié)果顯示cagS基因缺陷株的cagA mRNA表達(dá)量與CagA轉(zhuǎn)運(yùn)量與野生株無異，同時檢測細(xì)胞的IL

10、-8mRNA表達(dá)量與IL-8的分泌量，結(jié)果顯示cagS基因缺失株誘導(dǎo)IL-8表達(dá)與分泌的能力明顯下降;比較H.pylori野生株和cagS基因缺陷株中五種已知Cag-T4SS重要的結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示CagI、CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了cagS基因原核表達(dá)載體pET-30a-cagS，并獲得目的融合蛋白CagS，免疫小鼠后，獲得了鼠抗CagS蛋白的多

11、克隆抗血清。
　　2.成功構(gòu)建了自殺質(zhì)粒pBlueKM40-△cagS::kan，并且獲得了一株cagS基因缺陷株△cagS。
　　3.初步確定了CagS蛋白的亞細(xì)胞定位，位于菌體膜部位;證明了cagS基因缺失并不會影響H.pylori cagA mRNA的表達(dá)，也不影響其CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的能力;證明了cagS基因的缺失會降低H.pylori誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)及分泌IL-8的能力;證明了cagS基因缺失對Cagl、CagM、C