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文檔簡介
1、背景:惡性腫瘤的早期淋巴道轉(zhuǎn)移致患者死亡率高、預(yù)后差,其發(fā)生機制一直是腫瘤學(xué)的研究難題。小鼠肝癌細胞Hca-F和Hca-P具有相同遺傳背景,它們來自同一小鼠腹水肝癌細胞克隆的不同亞克隆,且Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75%),Hca-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25%),是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的理想細胞模型。
Crk最初作為一種癌基因產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor10)中,
2、主要由SH2(src homology2)和SH3結(jié)構(gòu)域組成。Crk家族包括三個成員:CrkⅠ、CrkⅡ和CrkL,在各種組織中廣泛表達。信號接頭蛋白CrkL(Crk-Like)是Crk家族成員之一,近年來研究表明:CrkL異常表達與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān),但CrkL與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮有報道。
本研究組前期通過Western blot發(fā)現(xiàn),CrkL在小鼠高、低淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞株Hca-F和Hca-P中表達差異顯著,其在H
3、ca-P中的表達是Hca-F中的3.05倍(P<0.05),提示CrkL的表達水平與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能是潛在的抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)分子。本研究通過RNA干擾技術(shù),下調(diào)CrkL在Hca-P中的表達,進一步探索CrkL對腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移細胞生物學(xué)行為的影響。
目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌低淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞Hca-P中,獲得CrkL表達穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P細胞
4、株;2、研究CrkL下調(diào)對Hca-P細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;3、研究CrkL下調(diào)對Hca-P細胞致鼠成瘤性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的影響。
方法:1、依據(jù)CrkL的mRNA序列(GenBank:BC131984),利用siDirect和whitehead軟件設(shè)計針對CrkL的siRNA,同時設(shè)計無關(guān)序列作為陰性對照。利用Lipofectamine2000介導(dǎo)法,將構(gòu)建好的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達載體
5、及pGPU6/GFP/Neo-shRNA-control無關(guān)序列表達載體分別轉(zhuǎn)染至Hca-P細胞中,24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,經(jīng)400μg/ml G418篩選及有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hca-P單克隆細胞株。采用Western blot驗證各組單克隆細胞、單克隆無關(guān)序列細胞及Hca-P細胞株中CrkL蛋白的表達水平。2、CCK-8法測定CrkL下調(diào)對Hca-P細胞增殖能力的影響;Transwell小室測定CrkL下調(diào)對Hca-
6、P細胞遷移及侵襲能力的影響;3、小鼠足墊種植法分析CrkL下調(diào)對小鼠足墊成瘤性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
結(jié)果:1、設(shè)計了3條針對CrkL的siRNA,且成功構(gòu)建了3種重組質(zhì)粒:pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-707、 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-732和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-560并篩選得到15株單克隆細胞株。Western blot結(jié)果表明:相對于陰
7、性對照組,在707-7、732-3和560-4單克隆細胞中CrkL在蛋白水平明顯下調(diào),其下調(diào)率分別為63.34%、93.12%和96.15%,可作為后續(xù)功能實驗細胞株。2、CCK-8細胞增殖檢測結(jié)果顯示707-7、732-3和560-4單克隆細胞在培養(yǎng)96 h時間點增殖迅速,顯著高于陰性對照組(P<0.05); Transwell小室細胞遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示707-7、732-3和560-4單克隆細胞的遷移數(shù)及侵襲數(shù)明顯多于陰性對照組
8、(P<0.05);3、體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明,CrkL下調(diào)促進小鼠足墊的成瘤性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。
結(jié)論:1、成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達載體;獲得15株CrkL表達穩(wěn)定下調(diào)且干擾效率不同的單克隆細胞株,為進一步研究CrkL在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ);2、CrkL下調(diào)能夠促進Hca-P細胞的增殖、遷移和侵襲能力;3、CrkL下調(diào)能夠促進小鼠足墊的成瘤性及體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率;4、CrkL在肝癌細
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