CRKL過表達(dá)抑制小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞體外增殖，遷移和侵襲能力.pdf

1、背景:轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學(xué)特征，涉及細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞遷移等復(fù)雜過程，一直是腫瘤防治的重大課題和難點(diǎn)。淋巴結(jié)通常是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的第一個(gè)器官，惡性腫瘤早期淋巴道轉(zhuǎn)移是患者死亡率高預(yù)后性差的重要原因，是一個(gè)涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程，其轉(zhuǎn)移機(jī)制不清。
　　小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株Hca-P和Hca-F是一對小鼠肝癌亞克隆細(xì)胞系，它們的遺傳背景相同，但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能是顯著不同的，其中Hca

2、-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25％），Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75％），是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的理想細(xì)胞模型。
　　信號接頭蛋白CRKL，是CRK家族成員之一，在真核生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與多種致癌信號通路，與一些癌癥的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān)，已成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)分子。本課題組前期采用Westem blot技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CRKL在Hca-P中的表達(dá)是Hca-F中的3.05倍（P＜0.05），并

3、通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Hca-P細(xì)胞CRKL表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CRKL下調(diào)明顯促進(jìn)Hca-P細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能，提示CRKL的表達(dá)水平與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能是潛在的抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)分子。
　　目的:1.構(gòu)建pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL和pEGFP-N1-CRKL真核表達(dá)質(zhì)粒;2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞，激光共聚焦定位CRKL-GFP融合蛋白;3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3

4、.1-V5/HisB-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞，Western blot檢測CRKL蛋白過表達(dá)水平;4.探究瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL質(zhì)粒后，CRKL過表達(dá)對Hca-P細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力的影響，為進(jìn)一步研究淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.根據(jù)CRKL的CDS及pcDNA3.1/V5-HisB和pEGFP-N1載體，對應(yīng)設(shè)計(jì)引物對-1和引物對-2;2.RT-PCR方法擴(kuò)

5、增小鼠CRKL的CDS全長，產(chǎn)物純化后與pEASY-blunt simple cloning vector進(jìn)行克隆，獲得原核克隆質(zhì)粒pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-blunt simple-CRKL-2，分別進(jìn)行單雙酶切及測序鑒定。將原核克隆質(zhì)粒、pcDNA3.1/V5-HisB和pEGFP-N1空質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，純化目的片段并連接，獲得pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL和pEGFP-N1-C

6、RKL真核表達(dá)質(zhì)粒，并分別進(jìn)行單雙酶切及測序鑒定;3.采用Lipofectamine(R)2000轉(zhuǎn)染試劑，將pEGFP-N1-CRKL及pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，激光共聚焦顯微鏡定位CRKL-GFP融合蛋白;4.采用Lipofectamine(R)2000轉(zhuǎn)染試劑，將pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL及pcDNA3.1/V5-HisB空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌H

7、ca-P細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，采用Western blot檢測CRKL蛋白過表達(dá)水平;5.CCK-8法檢測CRKL表達(dá)上調(diào)對Hca-P細(xì)胞增殖能力的影響，軟瓊脂克隆形成法檢測CRKL表達(dá)上調(diào)對Hca-P細(xì)胞克隆形成能力的影響，Transwell小室法檢測CRKL表達(dá)上調(diào)對Hca-P細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:1.酶切及測序結(jié)果顯示，pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-bluntsimple

8、-CRKL-2克隆質(zhì)粒、pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL和pEGF P-N1-CRKL真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒中CRKL序列完全正確;2.激光共聚焦結(jié)果顯示，CRKL蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中;3.Western blot結(jié)果顯示，與pcDNA3.1/V5-HisB-Hca-P和Hca-P組相比，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P組CRKL與CRKL-His總表達(dá)水平分別上調(diào)了1.69和1.39倍，且只有

9、pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P組檢測到CRKL-His Tag融合蛋白;4.CCK-8細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組相比細(xì)胞增殖速度明顯減慢;軟瓊脂克隆形成結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組相比細(xì)胞克隆形成能力明顯降低;Transwell小室結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組細(xì)胞相比細(xì)胞遷

10、移以及細(xì)胞侵襲能力顯著下降。
　　結(jié)論:1.成功構(gòu)建了pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-blunt simple-CRKL-2克隆質(zhì)粒;成功構(gòu)建了pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL和pEGFP-N1-CRKL真核表達(dá)質(zhì)粒;2.CRKL蛋白主要分布于Hca-P細(xì)胞質(zhì)中;3.CRKL過表達(dá)抑制Hca-P細(xì)胞的增殖能力;4.CRKL過表達(dá)抑制Hca-P細(xì)胞的克隆形成能力;5.CRKL過表達(dá)抑制Hca