lncRNA和miRNA在奶牛乳品質(zhì)調(diào)控中的作用.pdf

1、非編碼RNA在器官發(fā)育、組織細(xì)胞中的作用和功能越來越受到生物研究者的關(guān)注，以往的研究報道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA作為一種小分子非編碼RNA，在很多生命活動中都展現(xiàn)出重要的調(diào)控作用。miRNA對于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后也起到了關(guān)鍵的作用，在嚙齒類和反芻類泌乳過程中的研究也顯示miRNA可以通過多個關(guān)鍵基因調(diào)控泌乳。lncRNA是非編碼RNA中的一種，長度超過200個堿基，很早被發(fā)現(xiàn)但是一直被人們認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的沒有功能的副產(chǎn)物。近來的

2、研究人們發(fā)現(xiàn)lncRNA成員中的XIST被可以使X染色失活，進(jìn)而使人們意識到原來lncRNA具有調(diào)控功能。lncRNA所涉及的功能還可以在基因水平上通過順式或反式作用調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與否，另一方面也可以形成miRNA分子海綿通過對miRNA的吸附從而影響相應(yīng)mRNA的穩(wěn)定。本研究應(yīng)用不同品質(zhì)荷斯坦奶牛乳腺組織（高品質(zhì)、低品質(zhì)和干乳期）為實驗材料，應(yīng)用高通量測序技術(shù)，分別建立不同品質(zhì)奶牛乳腺組織中長鏈非編碼RNA表達(dá)文庫及small R

3、NA表達(dá)文庫，繼而鑒定并篩選參與奶牛乳品質(zhì)調(diào)控的lncRNA與miRNA，并應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)建立lncRNA、miRNA、mRNA調(diào)控乳品質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)為了得到高乳品質(zhì)組與低乳品質(zhì)組組間lncRNA的差異表達(dá)情況，在測序得到的lncRNA進(jìn)行了差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示有53個lncRNA差異表達(dá)，其中27個上調(diào)，26個下調(diào)。這些差異表達(dá)的lncRNA很可能對乳品質(zhì)的差異有作用。
　　(2)本實驗中

4、，我們借助已有的實驗分組嘗試性地尋找了一些能夠與乳腺發(fā)育相關(guān)的核心差異miRNA。高乳品質(zhì)組比干乳期組差異表達(dá)miRNA與低乳品質(zhì)組比干乳期組差異表達(dá)miRNA的交集miRNA有25個通過我們的分析結(jié)果顯示這些miRNA很有可能在奶牛乳腺發(fā)育過程中發(fā)揮核心調(diào)控的作用，其中miR-138、miR-296-3p、miR-20b、miR-106a、miR-135a、miR-503-5p、miR-433、miR-543、miR-370這9個mi

5、RNA的功能分析結(jié)果顯示它們可以通過靶基因參與乳腺上皮細(xì)胞的增殖、乳腺導(dǎo)管和腺泡的發(fā)育等功能。這些分析結(jié)果達(dá)到了我們預(yù)期的分析目的。因此這些miRNA很值得進(jìn)一步研究。
　　(3)通過聯(lián)合高乳品質(zhì)組與低乳品質(zhì)組組間差異miRNA和mRNA的分析，從結(jié)果中我們得到了miRNA與mRNA的負(fù)調(diào)控靶向關(guān)系。功能分析結(jié)果顯示miR-214、miR-154b、miR-9-5p、miR-2888等38個miRNA對乳品質(zhì)的差異有調(diào)控作用。通過

6、結(jié)合這些miRNA的253個負(fù)調(diào)控靶基因我們構(gòu)建了一個簡化的蛋白和脂代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，從結(jié)果得知KDR(miR-424-5p和miR-450b)、IGF2(miR-409、miR-9-5p、miR-182和miR-31)、IRS1(miR-214、miR-424-5p和miR-154b)、TGFB3(bta-miR-2888)、SREBF1(bta-miR-154b)、PFKFB3(bta-miR-2888)和PCK2(bta-miR-3

7、82)這7個差異基因可以被相應(yīng)的miRNA所調(diào)控。這些基因均能夠通過相應(yīng)的信號通路調(diào)控蛋白和脂的合成，因此能夠與這些基因具有靶向關(guān)系的miRNA有著重要的調(diào)控作用。
　　(4)由研究報道可知lncRNA可以形成ceRNA調(diào)控機(jī)制。因此在本實驗中我們對lncRNA的ceRNA調(diào)控關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建。由高乳品質(zhì)組與低乳品質(zhì)組組間差異miRNA、mRNA和lncRNA的分析結(jié)果可知各基因的差異表達(dá)趨勢，結(jié)合靶基因關(guān)系預(yù)測結(jié)果，最終形成了ceR

8、NA調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步對ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行了功能富集分析和通路富集分析，結(jié)果顯示這些lncRNA可以通過調(diào)控相關(guān)的基因來影響乳品質(zhì)。
　　(5)為了驗證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過熒光定量PCR實驗測得了一些miRNA、mRNA和lncRNA的表達(dá)情況，通過分析這些基因的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果相一致，因此測序結(jié)果的準(zhǔn)確性得到了驗證。通過雙熒光素酶實驗我們鑒定了2個ceRNA關(guān)系，結(jié)果分析顯示miRNA具有與