LncRNA GAS5在小膠質(zhì)細(xì)胞極化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)是一種主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的炎性脫髓鞘性疾病，臨床表現(xiàn)為全身多系統(tǒng)的神經(jīng)功能障礙。MS在發(fā)病初期尚可在治療后緩解，但后期轉(zhuǎn)變?yōu)槔^發(fā)進(jìn)展型，進(jìn)行性惡化不再緩解。目前，進(jìn)展型MS尚缺乏確切有效的治療手段，尋找合適的治療策略和新靶點(diǎn)至關(guān)重要。
　　在目前的研究和治療中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥調(diào)控一直是控制MS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。最近的研究表明，MS不僅是一種中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，也是神經(jīng)退行性疾病，退行性改變與炎癥性反應(yīng)相互促進(jìn)加重疾病的進(jìn)展。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞以及聯(lián)結(jié)固有免疫和獲得性免疫的橋梁，不僅影響了MS的炎癥進(jìn)程，而且在MS的神經(jīng)退行性改變中也發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在外界不同因子刺激下激活后可表現(xiàn)為兩種不同的功能狀態(tài)，一種狀態(tài)下大量分泌炎性因子和毒性物質(zhì)，發(fā)揮促炎和清除異物作用;另一種功能狀態(tài)下則大量分泌抗炎因子和神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)，發(fā)揮抗炎和促修復(fù)作用。這

3、兩種功能狀態(tài)分別稱為M1型/經(jīng)典型和M2型/非經(jīng)典型極化。闡明小膠質(zhì)細(xì)胞M1型與M2型的極化機(jī)制是調(diào)控其功能的重要著力點(diǎn)，而目前對(duì)M2型極化的調(diào)控機(jī)制了解更少，亟待進(jìn)一步研究。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp，沒有蛋白編碼功能的RNA分子。近年來隨著芯片和測序技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)lncRNAs不僅被廣泛轉(zhuǎn)錄，而且在幾乎所有生物學(xué)過程中都存在相應(yīng)的表達(dá)變

4、化，而大量的相關(guān)研究也使得越來越多有功能的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。隨著功能研究的深入，lncRNAs對(duì)環(huán)境變化高度敏感、廣泛存在、作用方式多樣等特性得到公認(rèn)，被認(rèn)為是表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的重要承擔(dān)者。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，lncRNAs不僅表達(dá)于各種類型的腦細(xì)胞中，而且腦中表達(dá)譜占所有已發(fā)現(xiàn)的lncRNAs的比例可能是所有器官中最高的，可能具有較其他系統(tǒng)更為重要的作用，而對(duì)lncRNAs在小膠質(zhì)細(xì)胞功能和MS的疾病進(jìn)展中發(fā)揮何種作用，目前還不清楚

5、。
　　研究方法:
　　本研究擬采用lncRNAs芯片比較分析靜息型與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的lncRNAs表達(dá)譜，通過差異表達(dá)分析和共表達(dá)分析等生物信息學(xué)手段尋找可能在小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化調(diào)控中具有作用的lncRNAs。針對(duì)特定篩選出的分子，將綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和行為學(xué)等研究手段進(jìn)一步闡明其作用形式與分子機(jī)制，以期深入認(rèn)識(shí)lncRNAs在小膠質(zhì)細(xì)胞極化過程中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　我們通過芯

6、片篩選發(fā)現(xiàn)，總共有120條lncRNAs在小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化過程中存在表達(dá)變化，其中l(wèi)ncRNA growth arrest-specific5(GAS5)在IL-4刺激后的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。在體外原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，通過過表達(dá)與干擾實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)GAS5可以抑制Ym-1、Fizz-1、CD206、IGF-1等M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)增加TNF-α、IL-1β等M1型炎性因子的分泌。GAS5基因修飾的小膠質(zhì)

7、細(xì)胞條件上清顯著影響共培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的凋亡、分化和神經(jīng)元的突起生長。在體內(nèi)，將GAS5基因修飾的小膠質(zhì)細(xì)胞移植入MS的動(dòng)物模型EAE小鼠可影響疾病進(jìn)展。干擾GAS5的小膠質(zhì)細(xì)胞移植入溶血軟磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)的局部脫髓鞘模型小鼠可促進(jìn)髓鞘再生。通過RNA-IP、RNA-pull down和ChIP等實(shí)驗(yàn)進(jìn)

8、一步研究發(fā)現(xiàn)，GAS5通過與PRC2結(jié)合，調(diào)節(jié)控制極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4的轉(zhuǎn)錄。此外，我們發(fā)現(xiàn)GAS5在老年小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)較青年小鼠明顯升高。在MS病人腦片中，我們發(fā)現(xiàn)GAS5在傾向于M1型的阿米巴樣的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)更高。我們的結(jié)果表明lncRNAs參與了對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控，GAS5在小膠質(zhì)細(xì)胞極化調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其作用是通過調(diào)節(jié)控制極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。此外，我們的研究也部分揭示了老年小鼠中樞神

9、經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化障礙的原因。
　　研究結(jié)論:
　　1、LncRNAs參與了小膠質(zhì)細(xì)胞極化調(diào)控過程，其中l(wèi)ncRNA GAS5抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化并促進(jìn)其向M1型極化;
　　2、GAS5過表達(dá)或干擾的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著影響MS的動(dòng)物模型EAE小鼠的疾病進(jìn)展和LPC模型小鼠髓鞘再生過程，顯示GAS5在體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)揮中的重要作用;
　　3、GAS5主要通過結(jié)合體內(nèi)主要抑制性復(fù)合物PRC2抑制IRF