LncRNA GAS5在小膠質(zhì)細胞極化中的作用和機制研究.pdf

1、研究目的:
　　多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)是一種主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的炎性脫髓鞘性疾病，臨床表現(xiàn)為全身多系統(tǒng)的神經(jīng)功能障礙。MS在發(fā)病初期尚可在治療后緩解，但后期轉(zhuǎn)變?yōu)槔^發(fā)進展型，進行性惡化不再緩解。目前，進展型MS尚缺乏確切有效的治療手段，尋找合適的治療策略和新靶點至關重要。
　　在目前的研究和治療中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥調(diào)控一直是控制MS發(fā)生、發(fā)展的關鍵。最近的研究表明，MS不僅是一種中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，也是神經(jīng)退行性疾病，退行性改變與炎癥性反應相互促進加重疾病的進展。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞以及聯(lián)結(jié)固有免疫和獲得性免疫的橋梁，不僅影響了MS的炎癥進程，而且在MS的神經(jīng)退行性改變中也發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細胞在外界不同因子刺激下激活后可表現(xiàn)為兩種不同的功能狀態(tài)，一種狀態(tài)下大量分泌炎性因子和毒性物質(zhì)，發(fā)揮促炎和清除異物作用;另一種功能狀態(tài)下則大量分泌抗炎因子和神經(jīng)保護性物質(zhì)，發(fā)揮抗炎和促修復作用。這

3、兩種功能狀態(tài)分別稱為M1型/經(jīng)典型和M2型/非經(jīng)典型極化。闡明小膠質(zhì)細胞M1型與M2型的極化機制是調(diào)控其功能的重要著力點，而目前對M2型極化的調(diào)控機制了解更少，亟待進一步研究。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp，沒有蛋白編碼功能的RNA分子。近年來隨著芯片和測序技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)lncRNAs不僅被廣泛轉(zhuǎn)錄，而且在幾乎所有生物學過程中都存在相應的表達變

4、化，而大量的相關研究也使得越來越多有功能的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)。隨著功能研究的深入，lncRNAs對環(huán)境變化高度敏感、廣泛存在、作用方式多樣等特性得到公認，被認為是表觀遺傳調(diào)控機制的重要承擔者。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，lncRNAs不僅表達于各種類型的腦細胞中，而且腦中表達譜占所有已發(fā)現(xiàn)的lncRNAs的比例可能是所有器官中最高的，可能具有較其他系統(tǒng)更為重要的作用，而對lncRNAs在小膠質(zhì)細胞功能和MS的疾病進展中發(fā)揮何種作用，目前還不清楚

5、。
　　研究方法:
　　本研究擬采用lncRNAs芯片比較分析靜息型與M2型小膠質(zhì)細胞的lncRNAs表達譜，通過差異表達分析和共表達分析等生物信息學手段尋找可能在小膠質(zhì)細胞M2型極化調(diào)控中具有作用的lncRNAs。針對特定篩選出的分子，將綜合運用分子生物學、細胞生物學、形態(tài)學和行為學等研究手段進一步闡明其作用形式與分子機制，以期深入認識lncRNAs在小膠質(zhì)細胞極化過程中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　我們通過芯

6、片篩選發(fā)現(xiàn)，總共有120條lncRNAs在小膠質(zhì)細胞向M2型極化過程中存在表達變化，其中l(wèi)ncRNA growth arrest-specific5(GAS5)在IL-4刺激后的M2型小膠質(zhì)細胞中表達明顯下調(diào)。在體外原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞中，通過過表達與干擾實驗我們發(fā)現(xiàn)GAS5可以抑制Ym-1、Fizz-1、CD206、IGF-1等M2型小膠質(zhì)細胞的標志物表達，同時增加TNF-α、IL-1β等M1型炎性因子的分泌。GAS5基因修飾的小膠質(zhì)

7、細胞條件上清顯著影響共培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的凋亡、分化和神經(jīng)元的突起生長。在體內(nèi)，將GAS5基因修飾的小膠質(zhì)細胞移植入MS的動物模型EAE小鼠可影響疾病進展。干擾GAS5的小膠質(zhì)細胞移植入溶血軟磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導的局部脫髓鞘模型小鼠可促進髓鞘再生。通過RNA-IP、RNA-pull down和ChIP等實驗進

8、一步研究發(fā)現(xiàn)，GAS5通過與PRC2結(jié)合，調(diào)節(jié)控制極化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4的轉(zhuǎn)錄。此外，我們發(fā)現(xiàn)GAS5在老年小鼠小膠質(zhì)細胞中的表達較青年小鼠明顯升高。在MS病人腦片中，我們發(fā)現(xiàn)GAS5在傾向于M1型的阿米巴樣的小膠質(zhì)細胞中表達更高。我們的結(jié)果表明lncRNAs參與了對小膠質(zhì)細胞極化的調(diào)控，GAS5在小膠質(zhì)細胞極化調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其作用是通過調(diào)節(jié)控制極化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。此外，我們的研究也部分揭示了老年小鼠中樞神

9、經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞M2型極化障礙的原因。
　　研究結(jié)論:
　　1、LncRNAs參與了小膠質(zhì)細胞極化調(diào)控過程，其中l(wèi)ncRNA GAS5抑制了小膠質(zhì)細胞向M2型極化并促進其向M1型極化;
　　2、GAS5過表達或干擾的小膠質(zhì)細胞顯著影響MS的動物模型EAE小鼠的疾病進展和LPC模型小鼠髓鞘再生過程，顯示GAS5在體內(nèi)小膠質(zhì)細胞功能發(fā)揮中的重要作用;
　　3、GAS5主要通過結(jié)合體內(nèi)主要抑制性復合物PRC2抑制IRF