MAPK1和eEF1B對奶牛乳腺上皮細胞泌乳調(diào)控作用及機理研究.pdf

1、我國是一個奶業(yè)大國，但奶牛產(chǎn)奶量低、發(fā)病率高嚴重制約著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如何提高乳產(chǎn)量及乳蛋白含量成為我們亟待解決的問題。蛋氨酸和賴氨酸是乳蛋白合成的重要前體物質(zhì)，以前的研究主要側(cè)重于蛋氨酸和賴氨酸對奶牛生產(chǎn)性能的影響，而對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞的促進泌乳和增殖作用研究較少。為了確定泌乳期奶牛乳蛋白合成的功能基因，揭示重要功能基因在乳蛋白合成中的作用機制，建立乳腺中乳蛋白合成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中的作用，為建立

2、乳腺泌乳調(diào)控技術(shù)提供基本理論依據(jù)和研究技術(shù)方法。
　　 本研究采用組織塊兒培養(yǎng)法，成功構(gòu)建了體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞模型，應(yīng)用CASY細胞分析儀檢測了不同濃度和作用時間下蛋氨酸和賴氨酸對奶牛乳腺上皮細胞活力的影響，利用高效液相色譜檢測了β-casein的分泌情況，確定了蛋氨酸和賴氨酸最佳劑量分別為0.6mmol/L和1.2mmol/L，最佳作用時間為24h。建立奶牛乳腺上皮細胞核磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)，應(yīng)用雙向電泳（2-DE）結(jié)合

3、質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)鑒定蛋氨酸和賴氨酸對奶牛乳腺上皮細胞核磷酸化蛋白質(zhì)的差異影響，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸處理組，Staphylococcal nucleasedomain-containing protein1、Glycyl-tRNA synthetase、Septin-6、Twinfilin-1和Elongationfactor1-beta(eEF1B)蛋白質(zhì)表達上調(diào)，賴氨酸處理組，SKIV2L2、sec-related prot

4、ein D、T-complex protein1 subunit delta、protein disulfide-isomerase A3、coronin actin binding protein1C和mitogen-activated protein kinase1(MAPK1)蛋白質(zhì)表達上調(diào);并應(yīng)用熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)驗證差異蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上的表達，與2-DE結(jié)果一致。實驗過程中，采用基因

5、沉寂技術(shù)，qRT-PCR鑒定eEF1B(P＜0.05)和MAPK1基因沉寂有效（P＜0.01），應(yīng)用Western blotting檢測了沉寂eEF1B后，mTOR(P＜0.05)、Phospho-mTOR(P＜0.05)、GARS（P＜0.05）和SND1（P＜0.05）蛋白表達降低，并且差異顯著，而Stat5（P＞0.05）和Phospho-Stat5（P＞0.05）蛋白表達稍有降低，但差異不顯著;高效液相色譜檢測β-酪蛋白含量增加

6、，并且差異顯著（P＜0.05）。沉寂MAPK1后，mTOR(P＜0.05)、Phospho-mTOR(P＜0.01)、S6K1(P＜0.05)、Phospho-S6K1(P＜0.05)、Stat5(P＜0.05)和Phospho-Stat5(P＜0.05)蛋白表達降低，并且差異顯著;高效液相色譜檢測β-酪蛋白含量增加，并且差異極其顯著（P＜0.01）。采用基因過表達技術(shù)，qRT-PCR鑒定eEF1B(P＜0.01)和MAPK1基因表達增

7、高（P＜0.05），應(yīng)用Western blotting檢測了過表達eEF1B后，mTOR（P＜0.05）、Phospho-mTOR（P＜0.05）、GARS（P＜0.05）和SND1(P＜0.05)蛋白表達降低，并且差異顯著，而Stat5（P＞0.05）和Phospho-Stat5（P＞0.05）蛋白表達變化不明顯;高效液相色譜檢測β-酪蛋白含量增加，但差異不顯著（P＞0.05）。過表達MAPK1后，mTOR（P＜0.05）、Phos

8、pho-mTOR（P＜0.05）、S6K1（P＜0.05）和Stat5(P＜0.01)蛋白表達升高，并且差異顯著;而Phospho-S6K1、Phospho-Stat5蛋白表達升高，但差異不顯著（P＞0.05）;高效液相色譜檢測β-酪蛋白含量增加，并且差異極其顯著(P＜0.01)。實驗過程中通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGCMV-IRES-EGFP-eEF1B和pGCMV-IRES-EGFP-MAPK1的細胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，分別添加

9、蛋氨酸和賴氨酸，應(yīng)用Western blotting檢測了mTOR(P＜0.05)和Phospho-mTOR(P＜0.05)的表達變化，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸和賴氨酸營養(yǎng)素可以通過調(diào)節(jié)MAPK1和eEF1B介導(dǎo)mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而調(diào)節(jié)乳蛋白的表達。應(yīng)用細胞免疫沉淀和GST-pull down技術(shù)并聯(lián)合質(zhì)譜鑒定與MAPK1相互作用的蛋白有ARPC4、β-enolase、Annexin A2、Small G protein signaling m