PPARs與局灶性腦缺血再灌注損傷的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:1.觀察腦缺血再灌注損傷時過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARS）各亞型蛋白（PPARα、PPARβ/δ、PPARγ）表達(dá)的變化以及PPARs激動劑對PPARs表達(dá)的影響，并探討PPARs的改變在腦缺血再灌注損傷中的意義；2.以PPARs三亞型中的PPARγ為研究對象，觀察腦缺血再灌注損傷時其核移位的變化，以及PPARγ激動劑和拮抗劑對核移位

2、的影響，并初步探討PPARγ核移位在腦缺血再灌注損傷中的意義；3.觀察腦缺血再灌注損傷時12/15-脂氧酶（12/15-lipoxygenase，12/15-LOX）表達(dá)及其產(chǎn)物15-HETE含量的改變，以及12/15-LOX抑制劑和產(chǎn)物對PPARγ表達(dá)的影響，初步探討12/15-LOX途徑在PPARγ表達(dá)調(diào)控中的意義。
　　 方法:1.將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注模型組（I/R組）、治療組。制作大鼠MC

3、AO/R模型，缺血60min，再灌注24h。治療組于MCAO/R前30min給予PPAR全激動劑苯扎貝特（Bezafibrate，Beza）。使用神經(jīng)功能缺損評分、2％氯化三苯四唑（2，3,5-triphenyltetrazolium，TTC）染色對苯扎貝特在腦缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)行評價，免疫組化、Western blot檢測PPARs各亞型蛋白表達(dá)情況；2.將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注模型組（I/R組）、PPA

4、Rγ激動劑干預(yù)組（Ros組）、PPARγ抑制劑干預(yù)組（GW9662組）。其中I/R組，缺血均為60min，又根據(jù)再灌注時間分為2h、4h、8h、24h組。Ros組、GW9662組均于MCAO/R前30min給予相應(yīng)的藥物。使用神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色對PPARγ激動劑、抑制劑在腦缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)行評價，免疫組化、Western blot檢測PPARγ表達(dá)水平，免疫熒光檢測PPARγ在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的定位；3.將大鼠隨機(jī)分為Sha

5、m組、I/R組（60min/24h）、Baicalein干預(yù)組、15-羥基二十碳四烯酸（15-hydroxyeicosatetraenoic，15-HETE）干預(yù)組。Baicalein干預(yù)組、15-HETE干預(yù)組均于MCAO/R前30min給予相應(yīng)的藥物。使用免疫熒光雙標(biāo)檢測和Western blot檢測12/15-LOX、PPARγ表達(dá)，酶聯(lián)免疫法檢測15-HETE含量。
　　 結(jié)果:1.與假手術(shù)組相比，缺血60min再灌注2

6、4h（1）引起平均梗塞體積為44.30％，同時神經(jīng)功能缺損評分增加，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；（2）使腦組織PPARs各亞型表達(dá)均增加，分別增加了1.47倍、3.52倍和2.25倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（免疫組化檢測t值分別為8.63、9.29和13.62，Western blot檢測，值分別為8.16、9.24和6.43，均P=0.000）；同時PPARs各亞型免疫陽性細(xì)胞增加主要表現(xiàn)在缺血側(cè)半暗帶區(qū)域，而非缺血側(cè)（對側(cè)）表達(dá)沒有明

7、顯改變。與I/R組相比，PPAR全激動劑Beza（1）顯著降低腦梗死體積，平均減少54.36％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.69，P=0.000），同時mNSS降低，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；（2）進(jìn)一步增加PPARs各亞型表達(dá)，分別增加了95.45％、183.47％、224.61％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（免疫組化檢測t值分別為7.36、5.64和10.50，Western blotting檢測，值分別為13.02、17.52和13.6

8、4，均P=0.000）；同時不但使缺血側(cè)PPARs免疫陽性細(xì)胞增加，而且使非缺血側(cè)（對側(cè)）也增加。2.（1）I/R組與Sham組相比，①PPARγ總蛋白表達(dá)：Western blot檢測顯示，再灌注2h組未見明顯改變（t=-0.701，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義），再灌注4h組、8h組、24h組PPARγ總蛋白表達(dá)水平均增高，且呈再灌注時間依賴性增強(qiáng)（t=-15.749，-16.715，-22.839，均P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意

9、義）；免疫組化檢測與Western blot結(jié)果一致；②PPARγ成分蛋白表達(dá)：Western blot檢測顯示，Sham組胞漿、胞核內(nèi)均有PPARγ表達(dá)；I/R后，再灌注2h、4h、8h、24h組PPARγ在胞核內(nèi)的表達(dá)增加（與Sham組相比，t=-11.343、-27.191、-24.861、-25.75，均P<0.05），同時在胞漿內(nèi)的表達(dá)減少（與Sham組相比，t=7.197、9.031、10.777、13.78，均P<0.05

10、），且PPARγ的核移位改變呈再灌注時間依賴性；免疫熒光檢測與Western blot結(jié)果一致；（2）與I/R（60min/24h）組相比，①Ros組梗死體積減小了48.27％，而GW9662組梗死體積增加了39.52％；神經(jīng)功能缺損評分也呈現(xiàn)一致的改變（均為P<0.05，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義）；②PPARγ總蛋白和成分蛋白表達(dá)：Western blot檢測顯示，與I/R組（60min/24h）相比，PPARγ激動劑組（Ros組）PPAR

11、γ的總蛋白表達(dá)水平顯著增高（f=-23.465，P<0.05），核蛋白表達(dá)水平亦顯著增高（t=-33.788，P<0.05），漿蛋白表達(dá)水平則降低（t=6.428，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而PPARγ抑制劑組（GW9662組）PPARγ的總蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=29.403，P<0.05），核蛋白表達(dá)水平辦顯著降低（t=22.414，P<0.05），漿蛋白表達(dá)水平則增高（t=-6.826，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意

12、義；免疫熒光檢測與Western blot結(jié)果一致。3.（1）與Sham組相比，Western blot檢測顯示，I/R（60min/24h）組12/15-LOX總蛋白表達(dá)增高（t=-8.195，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義）；免疫熒光檢測顯示，12/15.LOX的表達(dá)主要位于缺血半暗帶，且其表達(dá)位置與PPARγ具有一致性；同時酶聯(lián)免疫檢測顯示，I/R組12/15-LOX產(chǎn)物15-HETE的含量明顯增加（t=-12.787，P<0.0

13、5，差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。（2）與I/R（60min/24h）組相比，同時給予不同劑量Baicalein（150mg/kg、200mg/kg）使PPARγ總蛋白（t=7.253，8.61，P<0.05）、核蛋白（t=15.361，26.922，P<0.05）表達(dá)均降低，漿蛋白（t=-17.579，-25.719，P<0.05）表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；Baicalein200mg/kg處理不同時間（缺血60min再灌注4h和24h）均

14、引起PPARγ總蛋白（t=2.773，11.650，P<0.05）、核蛋白（t=4.313，37.468，P<0.05）表達(dá)水平均降低，漿蛋白（t=-2.553，-8.246，P<0.05）表達(dá)水平增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；（3）與I/R（60min/24h）組相比，12/15-LOX產(chǎn)物15-HETE干預(yù)組PPARγ總蛋白（t=-23.884，P<0.05）、核蛋白（t=-15.36，P<0.05）表達(dá)水平均增高，漿蛋白（t=5.86

15、，P<0.05）表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1.局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織PPARs各亞型（PPARα、PPARβ/δ和PPARγ）表達(dá)增加，該改變可能是腦組織的一種代償性神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)；2.（1）腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)上調(diào)及核移位，最終引起細(xì)胞核內(nèi)PPARγ表達(dá)水平增高，即PPARγ核活性增加；（2）I/R時PPARγ核移位的發(fā)生早于表達(dá)水平上調(diào)，相對于增加蛋白水平，可能是機(jī)體調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因