終末期腎病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用機(jī)制研究.pdf

1、慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）現(xiàn)在已被認(rèn)為是導(dǎo)致心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）及死亡的危險(xiǎn)因素之一，尤其是發(fā)展至終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的患者，此風(fēng)險(xiǎn)將升高。
　　 在ESRD 患者中，CVD 死亡率更高。CVD 是ESRD 患者死亡的主要原因。ESRD 病人動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，A

2、S）的發(fā)生率比同齡一般人群高10~15 倍，發(fā)病年齡提前至30~40 歲，被稱之為“加速性AS”。
　　 ESRD 病人AS 加速發(fā)生的原因尚未闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與ESRD 病人普遍存在高血壓、高脂血癥等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素和一些尿毒癥所特有的危險(xiǎn)因素有關(guān)，后者包括微炎癥、氧化應(yīng)激和羰基應(yīng)激等近年倍受關(guān)注的病理生理征象。
　　 心血管是尿毒癥毒素主要的靶器官損害之一，即使在CKD 的早期階段，心血管損害已能引起CKD 及ESRD

3、 患者死亡率大幅升高。尿毒癥的諸多并發(fā)癥(如貧血、微炎癥狀態(tài)等)也對(duì)心血管的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，其中炎癥因子可以通過(guò)多種機(jī)制使CKD 患者發(fā)生CVD。CKD 患者的微炎癥狀態(tài)與前促凝素和血小板激活因子（血漿血管假性血友病因子和可溶性P-選擇素）有關(guān)，而這些因子又可以引起內(nèi)皮功能紊亂。本課題第一部分選取了ESRD 患者和健康人，用ELISA 法檢測(cè)其血清中炎癥因子和血管內(nèi)皮損傷相關(guān)因子的水平，觀察炎癥因子和內(nèi)皮損傷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ESRD 患

4、者組較正常健康組血清中白介素-8（interleukin-8, IL-8）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）分別升高了22.49 倍、45.46 倍、1.032倍，而ESRD 患者組較正常健康組血清中一氧化氮（nitric oxide, NO）降低了12.21％，ET-1/NO 比例失衡，本部分研究提示ESRD 患者處于微炎癥狀態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損

5、傷，內(nèi)皮功能紊亂。
　　 本研究第二部分用ESRD 患者血清（250ml/l）及甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）（0, 10-13, 10-12, 10-11, 10-10, 10-9 mol/l）作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells ,HUVEC），24 小時(shí)后，免疫組化法觀察血清對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，LDH 法檢測(cè)PTH 對(duì)

6、HUVEC 的細(xì)胞毒性，流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 法分別檢測(cè)血清和PTH 對(duì)HUVEC 細(xì)胞凋亡的影響，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)以及MTS 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，Real time PCR 法檢測(cè)HUVEC 分泌IL-8、ET-1、eNOS、vWF mRNA 水平，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8、ET-1、vWF 蛋白含量，硝酸鹽還原法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO 含量。
　　 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ESRD 患者血清可

7、明顯改變HUVEC 細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞核固縮、邊緣化，胞質(zhì)濃縮；PTH 處理HUVEC 細(xì)胞24h 后，10-10 mol/l 的PTH 即對(duì)HUVEC 存在細(xì)胞毒性，隨著濃度的增加，細(xì)胞毒性增大（P<0.01）。MTS 法結(jié)果顯示，不同濃度（100mL/L、150mL/L、200mL/L、250mL/L）ESRD 患者血清對(duì)HUVEC 增殖均有明顯抑制作用，與健康組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性; 臺(tái)盼

8、藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)和MTS 比色法結(jié)果顯示， 10-10 和10-9mol/l 的PTH 可使HUVEC 細(xì)胞增殖數(shù)明顯減少了23.48％和39.20％（臺(tái)盼藍(lán)染色），16.78％和25.46％（MTS 比色法）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ESRD 患者血清使HUVEC 凋亡細(xì)胞明顯增加[凋亡率（55.59±5.21）％]vs[凋亡率（12.20±6.20）％]；Hoechst 33258 染核顯示PTH 處理HUVEC 細(xì)胞2

9、4h 后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核聚集，邊緣化，及凋亡小體，表明細(xì)胞核已固縮碎裂，即明顯的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。
　　 10-12mol/l 濃度時(shí)即可出現(xiàn)極少量的凋亡細(xì)胞，10-11mol/l 時(shí)凋亡細(xì)胞增多，隨著PTH 濃度的增大，HUVEC 凋亡更為明顯。Real-time PCR 檢測(cè)顯示，ESRD 患者血清使HUVEC 分泌IL-8、ET-1、vWF mRNA 增多，而eNOSmRNA 明顯減少，ESRD 組分別為正常組的2.

10、85、10.30、3.26、0.12 倍；
　　 10-10 和10-9 mol/l 的PTH 可使HUVEC 分泌IL-8 mRNA 水平升高了0.49倍和1.04 倍， eNOS mRNA 水平升高了2.79 倍和24.91 倍， ET-1 mRNA水平升高了7.28 倍和20.39 倍， vWF mRNA 水平升高了0.86 倍和1.58倍。同樣，ESRD 患者血清使HUVEC 的上清液中IL-8、ET-1、vWF 蛋白含

11、量明顯增加，NO 水平降低，ESRD 組分別為正常組的1.30、1.13、1.34、0.24 倍；10-10 和10-9 mol/l 的PTH 可使HUVEC 分泌IL-8 蛋白增加了1.13 倍和1.37 倍，ET-1 蛋白增加了1.48 倍和1.74 倍。隨著PTH 濃度的增加，HUVEC 分泌vWF 蛋白呈上升趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 本部分研究提示ESRD 患者血清和PTH 可以直接損傷HUVEC。
　　

12、 體外研究證明ESRD 患者體內(nèi)存在慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)，長(zhǎng)期積累的尿毒癥毒素可促進(jìn)炎癥因子的合成和釋放，損傷血管內(nèi)皮，使AS 發(fā)生的危險(xiǎn)性增加。為了探討維持性血液透析（maintenance hemodialysis,MHD）患者AS 與炎癥因子IL-8 及中分子尿毒癥毒素PTH 之間的關(guān)系，本研究第三部分收集了108 例病情穩(wěn)定的MHD 患者，收集患者血清，測(cè)定生化指標(biāo)，ELISA 法檢測(cè)IL-8 濃度，放射免疫測(cè)定PTH 濃度，血管

13、彩色多普勒超聲檢測(cè)雙側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（common carotid arteryintima-media thickness ,CCA IMT）和收縮期峰值血流速度（peak systolicvelocities ，PSV）。根據(jù)血清IL-8 濃度將患者分為正常濃度IL-8 組[43.80±33.49（pg/ml）]和高濃度IL-8 組（>156pg/ml）[498.55±279.61（pg/ml）]。正常濃度IL-8 組和高濃度I

14、L-8 組年齡和血鈣（calcium ，Ca）
　　 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是高濃度IL-8 組血磷（phosphonium ，P）和PTH明顯高于正常濃度IL-8 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）。正常濃度IL-8組和高濃度IL-8 組右側(cè)CCA IMT 和PSV 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是高濃度IL-8 組左側(cè)CCA IMT 明顯大于正常濃度IL-8 組，而 PSV 小于正常濃度IL-8 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）。

15、而在高濃度IL-8 組中，左側(cè)CCA IMT 大于右側(cè)CCA IMT，左側(cè)CCA PSV 小于右側(cè)CCA PSV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）。所有患者左側(cè)CCA IMT 與IL-8 成正相關(guān)，左側(cè)CCA PSV 與IL-8 成負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明炎癥因子在ESRD 患者AS 進(jìn)展和CVD 的高發(fā)病率中起重要作用。而IL-8 與PTH 成正相關(guān)，這與第二部分實(shí)驗(yàn)中PTH 可誘導(dǎo)HUVEC 產(chǎn)生IL-8 相一致，因此推測(cè)PTH 除了對(duì)