N-乙酰半胱氨酸對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺損傷及NSIP患者肺成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分：口服乙酰半胱氨酸對博萊霉素大鼠肺損傷的作用研究 目的：研究口服乙酰半胱氨酸（NAC）對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺損傷的干預(yù)作用。 方法：240只SD大鼠，隨機(jī)分為6組：正常對照組，博萊霉素處理未治療模型組，NAC小劑量治療組（NAC100 Mg/kg.d），NAC大劑量治療組（NAC500Mg/kg.d），強(qiáng)的松組及NAC聯(lián)合強(qiáng)的松治療組。采用博萊霉素氣管內(nèi)注射建立模型，分別于造模后3、7、14及28天處死動(dòng)物，標(biāo)本

2、進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察及Ashcroft評分，采用酶聯(lián)免疫法檢測肺泡灌洗液中堿性成纖維細(xì)胞生長因子及血小板源性生長因子的水平。 結(jié)果：博萊霉素氣管內(nèi)注射后14天，各組大鼠肺組織病理組織學(xué)觀察示：正常PBS組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤；博萊霉素處理未治療組可見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生實(shí)變。NAC、強(qiáng)的松和聯(lián)合治療組肺組織損害減輕，炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生明顯減少。與未治療組相比，NAC大、小劑量組，強(qiáng)的松

3、以及聯(lián)合治療組肺損傷評分均顯著降低（P<0.01）。28天后，強(qiáng)的松組及聯(lián)合治療組評分基本恢復(fù)正常，而模型組，NAC大、小劑量組纖維化評分仍高于正常對照（P<0.05）。采用NAC大劑量，強(qiáng)的松及聯(lián)合治療后，肺組織羥脯氨酸含量顯著較未治療組降低（P<0.01）。至28天時(shí)，各組肺組織羥脯氨酸含量與正常對照相比均無顯著差異。未治療組肺泡灌洗液中bFGF與PDGF-BB水平在博萊霉素處理后第三天達(dá)高峰，（（212.69±55.11）和（66

4、3.96±195.47）pg/ml）顯著高于正常對照組（（41.60±20.49）和（54.92±24.33）pg/ml），P值分別為0.001和0.000，各治療組較未治療組上述兩種因子的水平均明顯下降。博萊霉素處理7天后未治療組兩種因子下降，至28天時(shí)基本與正常對照組相同。其他治療組變化趨勢基本相同。 結(jié)論：NAC作為一種抗氧化劑，早期干預(yù)能夠減輕博萊霉素所致大鼠的肺損傷：NAC的抗纖維化作用可能與其抗炎及調(diào)節(jié)肺組織局部生長

5、因子PDGF等的濃度有關(guān)；NAC與強(qiáng)的松聯(lián)合用藥可能不產(chǎn)生抗纖維化的協(xié)同作用。 第二部分乙酰半胱氨酸對非特異性間質(zhì)性肺炎患者肺成纖維細(xì)胞的影響 第一節(jié)NAC對正常與非特異性間質(zhì)性肺炎患者肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 目的：比較NAC對正常與非特異性間質(zhì)性肺炎（NSIP）患者肺成纖維細(xì)胞增殖的影響。 方法：分離培養(yǎng)NSIP患者及正常肺成纖維細(xì)胞，觀察正常肺成纖維細(xì)胞與NSIP患者肺成纖維細(xì)胞增殖及NAC的干預(yù)作用

6、，比較NAC同一劑量梯度對肺泡上皮細(xì)胞A549基礎(chǔ)增殖的影響。 結(jié)果：①20 mM NAC對原代培養(yǎng)的人肺成纖維細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，而對肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖無明顯影響。②5、10、20及40 mM NAC對正常及NSIP患者肺成纖維細(xì)胞增殖均具有抑制效應(yīng)。在正常肺成纖維細(xì)胞，NAC的抑制作用呈明顯的劑量依賴性，濃度達(dá)40 mM時(shí)細(xì)胞增殖基本中止。但在NSIP患者肺成纖維細(xì)胞，NAC對其增殖的抑制并不隨濃度升高而增

7、加，濃度在40 mM時(shí)，細(xì)胞仍持續(xù)增殖。③NAC能夠抑制肺成纖維細(xì)胞前膠原mRNA的合成，以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）誘導(dǎo)的前膠原mRNA的合成。 結(jié)論：1. NAC能夠抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，在一定濃度范圍內(nèi)抑制作用具有細(xì)胞特異性。 2.NSIP患者肺成纖維細(xì)胞對NAC的增殖抑制作用存在明顯耐受性。 3.NAC能夠直接抑制肺成纖維細(xì)胞的膠原合成。 第二節(jié)NSIP患者肺成纖維細(xì)胞對TGF-β1刺激

8、表達(dá)α-SMA的反應(yīng)性及NAC的干預(yù)作用 目的：比較NAC對正常肺成纖維細(xì)胞和NSIP患者肺成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響以及TGF-β1刺激的反應(yīng)性。 方法：利用已經(jīng)分離鑒定的正常及NSIP患者肺成纖維細(xì)胞，應(yīng)用免疫印跡法分別觀察NAC和TGF-β1刺激，以及NAC對TGF-β1刺激后的正常與NSIP患者肺成纖維細(xì)胞α-SMA及STAT3蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：①基態(tài)下，NSIP肺成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA水平較

9、正常肺成纖維細(xì)胞高（升高25.66%，P<0.05，與HFB相比），NAC處理可顯著增加NSIP肺成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)（升高40.85%，P<0.05，與對照組相比），但對正常肺成纖維細(xì)胞無影響。TGF-β1處理輕度增加了正常肺成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA，但對NSIP肺成纖維細(xì)胞卻呈現(xiàn)顯著下調(diào)作用（下降35.92%，P<0.05，與對照組相比）。此外，在NSIP肺成纖維細(xì)胞，如先用TGF-β1處理再添加NAC，則NAC誘導(dǎo)α-SMA

10、表達(dá)的作用被阻斷。②STAT3在正常肺成纖維細(xì)胞呈弱表達(dá)，TGF-β和NAC刺激沒有明顯影響。NSIP患者肺成纖維細(xì)胞基態(tài)下表達(dá)較高水平的STAT3（1.15±0.13，P<0.05，與HFB相比），NAC能夠進(jìn)一步增強(qiáng)其表達(dá)（1.89±0.28，P<0.01），TGF-β1可顯著抑制其表達(dá)（0.58±0.09，P<0.05），TGF-β1刺激后再添加NAC，其原先對STAT3的誘導(dǎo)效應(yīng)被阻斷（1.19±0.10，P<0.01）?；鶓B(tài)下

11、NSIP肺成纖維細(xì)胞即可表達(dá)磷酸化STAT3，TGF-β1刺激15分鐘后磷酸化STAT3完全被抑制；而TGF-β1可增加正常肺成纖維細(xì)胞磷酸化STAT3的表達(dá)。 結(jié)論： 1.NSIP患者肺成纖維細(xì)胞具有與正常肺成纖維細(xì)胞相比不同的生物學(xué)特性，基礎(chǔ)狀態(tài)下能夠表達(dá)較高水平的α-SMA與非磷酸化STAT3，以及活化狀態(tài)的磷酸化STAT3分子。 2.NAC能夠誘導(dǎo)NSIP患者肺成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，與其誘導(dǎo)了NSI

12、P細(xì)胞STAT3信號活化有關(guān)。 3.TGF-β1能夠下調(diào)NSIP肺成纖維細(xì)胞活化的STAT3信號，從而抑制了α-SMA的表達(dá)。 第三節(jié)TGF-β1對NSIP患者肺成纖維細(xì)胞釋放趨化因子及細(xì)胞因子的影響及NAC的作用 目的：比較TGF-β1對正常肺成纖維細(xì)胞和NSIP患者肺成纖維細(xì)胞趨化因子及細(xì)胞因子釋放的影響及NAC的干預(yù)作用。 方法：利用已分離鑒定的正常及NSIP患者肺成纖維細(xì)胞，采納液相芯片技術(shù)觀察正

13、常與NSIP患者肺成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β刺激后趨化因子和細(xì)胞因子的變化，以及添加NAC對TGF-β1介導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子釋放的影響。 結(jié)果：①在基礎(chǔ)狀態(tài)下，NSIP患者肺成纖維細(xì)胞較正常肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生較多的趨化因子及細(xì)胞因子如：MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIG、MCP-3、VCAM-1、TNF-α、TGF-β、ENA-78、MMP-9及IL-18。少數(shù)因子較正常肺成纖維細(xì)胞減少，如趨化因子IP-10，基質(zhì)金

14、屬蛋白酶MMP-7以及黏附分子ICAM-1。②TGF-β1能夠引起NSIP患者及正常肺成纖維細(xì)胞增加趨化因子及細(xì)胞因子生成釋放，NSIP肺成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生如ICAM-1、IL-18、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MMP-7及TNF-α等進(jìn)一步增加，顯著高于正常肺成纖維細(xì)胞；NAC添加能夠明顯抑制正常肺成纖維細(xì)胞在TGFβ1誘導(dǎo)下的趨化因子及細(xì)胞因子釋放，但對NSIP患者肺成纖維細(xì)胞，這種下調(diào)作用不明顯。⑨與正常肺

15、成纖維細(xì)胞的反應(yīng)性相反，TGF-β1能夠顯著提高NSIP患者肺成纖維細(xì)胞表達(dá)IP-10，NAC能夠進(jìn)一步抑制基態(tài)下低水平的IP-10的表達(dá)。 小結(jié)： 1.NSIP患者的肺成纖維細(xì)胞釋放多種趨化因子、炎癥細(xì)胞因子以及參與纖維化重要的細(xì)胞因子的能力較正常肺成纖維細(xì)胞顯著增加。 2.NAC對TGF-β1誘導(dǎo)下系列趨化因子、促炎因子及粘附分子的產(chǎn)生能力具有顯著抑制作用，但對NSIP肺成纖維細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。