人和鼠肝微粒體藥物代謝檢測(cè)平臺(tái)的建立及初步應(yīng)用研究.pdf

1、肝臟是人體重要的生物轉(zhuǎn)化場(chǎng)所，肝細(xì)胞的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sER)上鑲嵌著豐富的代謝酶，負(fù)責(zé)內(nèi)源及外源化合物的代謝。這其中包括主要的I相藥物代謝酶：細(xì)胞色素P450(CYP)及黃素單氧化酶(FMO)。破碎肝細(xì)胞后，制備人肝臟微粒體(HLM)，其上保留著這些酶。因此HLM可以用來(lái)進(jìn)行體外的藥物代謝研究，包括1.CYP反應(yīng)表型研究；2.基于CYP的藥物相互作用研究，以及代謝穩(wěn)定性的研究。藥物代謝的體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)有一定的相關(guān)性，體外研究有助于解釋

2、臨床數(shù)據(jù)，可用于評(píng)價(jià)藥物在人體內(nèi)潛在的代謝情況。采用體外研究早期發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)藥物代謝的途徑和產(chǎn)物，可以為臨床前研究提供明確的方向。本研究的目的是建立體外藥物代謝研究用的人和鼠肝微粒體藥物代謝模型，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行初探。 首先用改良后的Omura法，制備SD大鼠和混合人肝微粒體。制備好的人、鼠肝微粒體經(jīng)一氧化碳還原示差法對(duì)P450酶含量進(jìn)行測(cè)定。之后用熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)肝微粒體對(duì)熒光底物CEC、DBF、AMMC和EFC的代謝情況，初步判

3、斷肝微粒是否具有P450酶催化活性。定量結(jié)果顯示制備的人、鼠肝微粒體在450nm有明顯的吸收峰，測(cè)得P450酶含量分別為593～27pmoFmg和964.67～32pmoFmg。通過(guò)與四種熒光底物進(jìn)行多次酶活性檢測(cè)。除了EFC底物無(wú)明顯催化活性，人肝微粒體對(duì)AMMC的催化活性較弱外，人肝和鼠肝微粒體均可以與CEC、DBF底物作用，呈現(xiàn)出明顯而穩(wěn)定的催化活性，在一定范圍內(nèi)熒光信號(hào)隨著酶濃度增大而增大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。 其次用

4、高效液相色譜技術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)肝微粒體藥物代謝檢測(cè)平臺(tái)的可靠性，將肝微粒體與特異性探針底物bufumlol、coumarin、s-mephenytoin和nifedipine反應(yīng)，分析生成的產(chǎn)物，計(jì)算‰、‰值，根據(jù)CLinF％√‰計(jì)算內(nèi)在清除率。同時(shí)用2D6、2A6、2C19和3A4特異性抑制劑奎寧丁、反苯環(huán)丙胺及酮康唑?qū)θ恕⑹蟾挝⒘ｓw進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，察看抑制效應(yīng)強(qiáng)弱，求解IC50值。 結(jié)果顯示：鼠肝微粒體對(duì)探針底物bufuralol

5、和nifcdipinc有顯著的催化活性，而對(duì)coumarin和s-mcphcnytoin無(wú)代謝；人肝微粒體則對(duì)四種特異性探針底物均有明顯而穩(wěn)定的催化活性，所求得的‰、‰似和CLint值也與文獻(xiàn)報(bào)道的相符。特異性抑制劑對(duì)鼠肝微粒體均無(wú)抑制效應(yīng)，而對(duì)人肝微粒體則顯示出了較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，ICso值較小。通過(guò)多方面的比較，證明了本研究建立的人、鼠肝微粒體體外藥物代謝平臺(tái)的可行性和可靠性。熒光檢測(cè)和高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出一致性?；钚詼y(cè)定結(jié)果和