正常人肝微粒體CYP3A4-5藥物代謝活性的個(gè)體差異.pdf

1、CYP3A是細(xì)胞色素P450(CYP)家族中的主要成員，同屬CYP3A家族重要成員且同源性較高的CYP3A4、CYP3A5在肝臟表達(dá)非常豐富，參與許多外源性（藥物、環(huán)境毒物/致癌物）和內(nèi)源性物質(zhì)（固醇類激素）的代謝。由于CYP3A4/5代謝活性個(gè)體差異很大，許多研究針對(duì)CYP3A4/5活性個(gè)體差異的原因進(jìn)行了探討。早期研究主要將活性的個(gè)體差異歸因于基因多態(tài)性和環(huán)境因素，隨著研究進(jìn)一步深入，研究者認(rèn)識(shí)到表觀遺傳甚至蛋白間的相互作用也是引起

2、CYP3A4/5活性個(gè)體差異的原因。CYP3A4/5的立體結(jié)構(gòu)靈活多變，可參與許多物質(zhì)的代謝。由于底物的多樣性，因此CYP3A4/5對(duì)一種底物的代謝活性并不一定能夠反映其對(duì)另一種底物的代謝活性。鑒于此，美國(guó)FDA推薦探究CYP3A4/5活性時(shí)需使用兩種探針?biāo)幬铮ㄟ溥_(dá)唑侖和睪酮）。但至今未見(jiàn)采用大樣本的正常人肝微粒體研究CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動(dòng)力學(xué)間的相關(guān)性，并且大多數(shù)代謝活性的研究是在人體內(nèi)和重組酶系統(tǒng)中展開(kāi)的，前者不能

3、單一反映出CYP3A4/5的代謝過(guò)程，后者與人體內(nèi)環(huán)境有一定的差異。因此，人肝微粒體是與人體最接近的體外代謝研究平臺(tái)。
　　本研究擬以105例正常人肝微粒體為研究對(duì)象，以咪達(dá)唑侖和睪酮為探針底物，分別探討并比較CYP3A4/5對(duì)兩種探針底物代謝活性的個(gè)體差異，分別考察并比較基因多態(tài)性、人口學(xué)因素、環(huán)境因素、蛋白相互作用對(duì)CYP3A4/5代謝兩種探針底物活性的影響，同時(shí)分析了CYP3A4/5對(duì)兩種探針底物代謝活性的相關(guān)性。通過(guò)本研究

4、，以期闡明CYP3A4/5對(duì)不同底物代謝活性存在較大個(gè)體差異的原因，為臨床合理應(yīng)用經(jīng)CYP3A4/5代謝的藥物提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1肝臟標(biāo)本的收集
　　收集肝功能正常的肝血管瘤患者肝標(biāo)本105例，標(biāo)本均來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院。其中男性37例，女性68例，年齡為20-75歲，用藥史顯示，手術(shù)近期沒(méi)有服用能夠顯著影響CYP酶活性的藥物。
　　2人肝微粒體的制備
　　采用差速

5、離心法制備人肝微粒體，并且用Bradford法測(cè)定人肝微粒體的蛋白濃度。
　　3人肝微粒體代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動(dòng)力學(xué)
　　首先確定最佳孵育條件（合適的微粒體蛋白濃度和最佳孵育時(shí)間）。其次進(jìn)行肝微粒體體外溫孵實(shí)驗(yàn)，選取咪達(dá)唑侖和睪酮為CYP3A4\5底物，配制人肝微粒體孵育體系（探針底物、磷酸鹽緩沖液及水），預(yù)孵育后，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，蛋白沉淀終止反應(yīng)后離心取上清，HPLC法檢測(cè)代謝產(chǎn)物濃度。
　　4 CYP3A

6、4/5和CYP2D6的基因分型
　　采用基因組柱式提取試劑盒從肝組織中提取全基因組DNA，設(shè)計(jì)CYP3A4/5及CYP2D6特異性引物，用特定引物擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的片段，經(jīng)測(cè)序確定其基因型。
　　5統(tǒng)計(jì)方法
　　使用GraphPad Prism5.0求得每例標(biāo)本的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1人肝微粒體代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動(dòng)力學(xué)
　　分別以咪

7、達(dá)唑侖和睪酮為底物。人肝微粒體中CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint的中位數(shù)分別為：1.85μM、789.60pmol·min-1·mg-1 protein、464.60μL·min-1·mg-1protein，范圍分別為0.44~10.20μM、69.40~5035.00 pmol·min-1mg-1 protein及8.27~1673.53μL·min-1·mg-1 protein，Km、Vmax和C

8、Lint差異倍數(shù)分別為23.18、72.55和202.36倍。人肝微粒體中CYP3A4/5代謝睪酮的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km、Vmax和CLint的中位數(shù)分別為：41.46μM、4785.50 pmol·min-1·mg-1protein、107.09μL·min-1·mg-1protein，范圍分別為22.19~152.50μM、265.60~10679.00pmol·min-1mg-1protein及1.74~278.09μL·min-1

9、·mg-1protein，Km、Vmax和CLint差異倍數(shù)分別為6.87、40.21和159.82倍。
　　2咪達(dá)唑侖和睪酮酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性
　　采用Spearman檢驗(yàn)對(duì)咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，CYP3A4/5對(duì)咪達(dá)唑侖和睪酮代謝的Vmax呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性（r=0.643)，CLint呈現(xiàn)出弱相關(guān)性（r=0.245），Km不存在相關(guān)性。
　　3基因多態(tài)性對(duì)CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的影

10、響
　　3.1 CYP3A4/5的基因多態(tài)性對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響
　　結(jié)果顯示，CYP3A420230 G>A位點(diǎn)突變會(huì)增加咪達(dá)唑侖的Km和Vmax，對(duì)睪酮代謝沒(méi)有影響。CYP3A56986A>G位點(diǎn)突變會(huì)降低咪達(dá)唑侖的Km和Vmax，也會(huì)降低睪酮的Vmax，而CYP3A420070T>C的基因多態(tài)性對(duì)兩種底物的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無(wú)影響。
　　3.2 CYP2D6的基因多態(tài)性對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響
　　結(jié)果顯示，CYP

11、2D61661G>C基因多態(tài)性可影響咪達(dá)唑侖的Km，與GC基因型相比，CC基因型代謝咪達(dá)唑侖的Km降低，但對(duì)CLint和Vmax無(wú)影響。CYP2D61661G>C基因多態(tài)性對(duì)睪酮的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)影響。CYP2D6100C>T基因多態(tài)性可影響睪酮的Vmax，與CC基因型相比，CT基因型的Vmax升高，但對(duì)Km和CLint無(wú)影響。CYP2D6100C>T基因多態(tài)性對(duì)咪達(dá)唑侖的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無(wú)影響。
　　4吸煙、飲酒、性別和年齡對(duì)CYP

12、3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的影響
　　統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明，吸煙、飲酒、性別和年齡對(duì)人肝微粒體CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著的影響。
　　結(jié)論：
　　1．人肝微粒體CYP3A4/5對(duì)咪達(dá)唑侖和睪酮的代謝活性存在顯著的個(gè)體差異。
　　2．人肝微粒體CYP3A4/5對(duì)咪達(dá)唑侖和睪酮代謝的Vmax呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性（r=0.643)，CLint呈現(xiàn)出弱相關(guān)性（r=0.245），Km不存在相關(guān)性。<