結(jié)直腸癌早期分子事件的研究.pdf

1、研究背景:
　　結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)總的發(fā)病率可排在第三，死亡率排在第五。結(jié)直腸癌有一個(gè)特征性的病理變化過(guò)程，大部分的結(jié)直腸癌被認(rèn)為起源于良性的結(jié)直腸腺瘤。對(duì)結(jié)直腸癌早期階段，也就是腺瘤進(jìn)行基因組層面的研究將幫助我們更深入的了解腫瘤的發(fā)生，不但有助于我們找到腫瘤早期階段的分子標(biāo)志，可能可以用來(lái)預(yù)測(cè)腺瘤和癌的發(fā)生;也可以幫助我們進(jìn)一步理解腫瘤早期階段的分子信號(hào)通路，用來(lái)阻斷和預(yù)防腫瘤的發(fā)生。在腫瘤基因組中，不光是編碼基因

2、推動(dòng)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，非編碼基因如micro Ribonucleic acid（miRNA）也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。二代測(cè)序技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，極大地推動(dòng)了腫瘤基因組學(xué)的發(fā)展。在本課題中，我們用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)腺瘤的全外顯子以及miRNA進(jìn)行測(cè)序，用來(lái)尋找可以預(yù)測(cè)腺癌發(fā)生的分子標(biāo)志，以及幫助理解發(fā)生在腫瘤早期階段的信號(hào)通路。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　一、我們對(duì)來(lái)自同一例Ⅱ期結(jié)直腸癌病人的正常腸粘膜、腺瘤和腺癌組織

3、使用NimbleGen2.1M Human Exome Array捕獲芯片進(jìn)行外顯子捕獲，接著使用IlluminaGAⅡ測(cè)序儀進(jìn)行了測(cè)序。以正常腸粘膜作為對(duì)照，研究腺瘤和腺癌中的體細(xì)胞突變;在同一基因背景下，比較腺瘤和腺癌在基因組學(xué)上的差別。在使用SAMtools找出腺瘤和腺癌中的突變后，篩除非編碼區(qū)的突變、SNP以及同義突變，獲得腺瘤和腺癌中的非同義的體細(xì)胞突變。
　　二、將在第一部分研究中找到的突變?cè)?3個(gè)腺瘤和288個(gè)腺癌中

4、進(jìn)行驗(yàn)證;并收集整理腸癌腸癌常見(jiàn)的突變和常見(jiàn)的功能通路，共整理133個(gè)腸癌相關(guān)的突變基因，在40例腺瘤中進(jìn)行捕獲測(cè)序，篩查在腺瘤中的常見(jiàn)突變基因和通路。使用的軟件和流程和第一部分相同。
　　三、在3對(duì)正常粘膜、腺瘤和腺癌中進(jìn)行miRNA的平行測(cè)序，用來(lái)篩查發(fā)生在結(jié)直腸癌早期的異常表達(dá)或序列改變的miRNA。將測(cè)序獲得的序列與miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到各個(gè)組織中的miRNA表達(dá)量，標(biāo)準(zhǔn)化后在各個(gè)配對(duì)樣本之間比較，找出表達(dá)差異的m

5、iRNA。那些沒(méi)有比對(duì)到miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)上的序列，與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已知成熟miRNA序列進(jìn)行比對(duì)（只允許在特定位點(diǎn)的錯(cuò)配，即“種子序列”2到8號(hào)堿基）來(lái)找出發(fā)生了堿基突變的miRNA。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、在腺瘤中，我們發(fā)現(xiàn)了12個(gè)體細(xì)胞突變，在腺癌中，有42個(gè)體細(xì)胞突變。腺瘤和腺癌中的堿基變化特征接近。在我們發(fā)現(xiàn)的突變中，其中的大部分突變比如OR6X1, SLC15A3, KRTHB4, RBFOX1, LAM

6、A3, CDH2(0), BIRC6, NMBR,GLCCI1，EFR3A，和FTHL17在結(jié)腸腺瘤中是第一次被報(bào)道。對(duì)這些突變進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)Wnt通路，細(xì)胞黏附通路和泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路同時(shí)發(fā)生在腺瘤和腺癌中。如細(xì)胞黏附通路的CDH2(0)和LAMA3在腺瘤中突變，而NRXN3和COL4A6在腺癌中突變。
　　二、APC基因在腺瘤中突變頻率接近50％。細(xì)胞黏附通路相關(guān)的蛋白在40個(gè)腺瘤中有3個(gè)腺瘤發(fā)生了突變，相當(dāng)于約8％的

7、突變頻率。泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路相關(guān)的蛋白在40個(gè)腺瘤中有7個(gè)腺瘤發(fā)生了突變，相當(dāng)于17.5％的突變頻率。除了這2個(gè)通路外，DNA錯(cuò)誤修復(fù)基因發(fā)生突變的頻率也較高。在40個(gè)腺瘤中有4個(gè)腺瘤包含錯(cuò)配修復(fù)基因的突變，相當(dāng)于10％的突變頻率。
　　三、hsa-miR-135b*、hsa-miR-31和hsa-miR-503在腸癌中高表達(dá)，而在腺瘤也出現(xiàn)高表達(dá);miR-9和miR-195在腸癌中低表達(dá)，而在腺瘤中也出現(xiàn)了低表達(dá)，提示這些m

8、iRNA的異常表達(dá)和對(duì)編碼基因的調(diào)控出現(xiàn)在腺瘤階段。miRNA在腺瘤和腺癌中都存在序列變異，比如miR-376a-2、miR-381、miR-411、miR-503和miR-585存在SNP，而miR-625、miR-1974、miR-376c和miR-144存在體細(xì)胞突變，且都出現(xiàn)在在結(jié)直腸癌的早期階段。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　腺瘤和腺癌的基因組學(xué)特征接近，也有類(lèi)似數(shù)目的體細(xì)胞突變，但比配對(duì)的癌要少。WNT，細(xì)胞黏附、泛素介