Toll樣受體家族基因多態(tài)性與肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的關(guān)系.pdf

1、背景:
　　 中國(guó)是乙肝病情嚴(yán)重的國(guó)家之一,根據(jù)衛(wèi)生部2006年的全國(guó)人群乙肝血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示中國(guó)1～59歲人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18％。由乙肝病毒引起的肝炎,肝硬化和肝癌嚴(yán)重影響人民群眾的健康。肝移植是目前治療終末期乙肝相關(guān)疾病的有效手段之一,可以挽救患者生命和提高患者的生活質(zhì)量。但肝移植后乙肝復(fù)發(fā)是肝移植后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,目前世界多中心的報(bào)告顯示目前仍有許多患者發(fā)生肝移植后乙肝復(fù)發(fā)。目前有關(guān)肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的

2、機(jī)制尚不清楚,為肝移植界的一大世界性的難題。
　　 Toll樣受體家族是天然模式識(shí)別分子之一,在體內(nèi)分布廣泛,在各種免疫細(xì)胞上有大量Toll樣家族成員的表達(dá)。Toll樣受體家族通過(guò)識(shí)別各種病原微生物包括病毒,細(xì)菌,真菌,寄生蟲等,激活體內(nèi)非特異性和特異性免疫系統(tǒng),達(dá)到免疫防御的作用。目前有研究表明Toll樣受體家族不僅和感染疾病相關(guān),還與人類腫瘤疾病,過(guò)敏性疾病,自身免疫性疾病等密切相關(guān)。而且,通過(guò)激活Toll樣受體家族可以達(dá)到

3、抑制小鼠和細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制。Toll樣受體家族基因也同樣存在基因多態(tài)性,已有報(bào)道表明Toll樣受體家族基因基因多態(tài)性可能通過(guò)改變Toll樣受體家族信號(hào)傳導(dǎo)等方式影響人類的感染性疾病等。Toll樣受體家族的基因多態(tài)性在肝移植領(lǐng)域也有相關(guān)研究,被發(fā)現(xiàn)可能與移植物失功,死亡率及巨細(xì)胞病毒感染有關(guān)。
　　 目的:
　　 通過(guò)對(duì)Toll樣受體家族的41個(gè)標(biāo)簽基因多態(tài)性位點(diǎn)(Tag-SNP)進(jìn)行檢測(cè),與肝移植患者臨床資料集合后分

4、析,以期可以發(fā)現(xiàn)早期預(yù)測(cè)和治療肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)記和潛在的治療位點(diǎn)。
　　 研究方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)選取2004年至2008年在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰中心接受肝移植125例中國(guó)漢族患者。其中男性113名,女性12名,年齡23歲至68歲。患者術(shù)前都有乙肝相關(guān)疾病,其中肝癌41例,肝硬化75例,急性重癥肝炎9例。全部患者術(shù)后長(zhǎng)期隨訪。術(shù)后隨訪的時(shí)間均在一年以上,常規(guī)進(jìn)行乙肝病毒表面抗原,乙肝病毒DNA檢測(cè)。

5、>　　 通過(guò)肝移植資料庫(kù)收集患者肝移植術(shù)前和術(shù)后的臨床數(shù)據(jù),包括性別,年齡,肝移植原因,血型,術(shù)前MELD評(píng)分,術(shù)前HBeAg情況,免疫抑制劑方案等。肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn):肝移植術(shù)后兩次出現(xiàn)HBsAg陽(yáng)性或是乙肝病毒DNA＞105 copies/mL。
　　 收集肝移植患者外周血,采用Promega Maxwell@16全自動(dòng)DNA提取儀提取DNA。SnapShot技術(shù)應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的測(cè)定。對(duì)肝移植乙肝復(fù)發(fā)和未復(fù)

6、發(fā)患者的臨床數(shù)據(jù)(性別,年齡,MELD評(píng)分,病因,術(shù)前HBeAg情況,免疫抑制劑方案),位點(diǎn)基因型和等位基因采用卡方檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)納入多因素回歸分析。Hardy-Weinberg平衡,連鎖不平衡及單倍型采用Hapoview軟件和SNPStats網(wǎng)站(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)。P小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果:
　　

7、 125例病人均完成隨訪,按照肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn),共有12名患者發(fā)生了肝移植后乙肝復(fù)發(fā)。將肝移植患者按肝移植后乙肝復(fù)發(fā)與否分為兩大組,將兩組的臨床資料進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),非肝癌肝移植患者(肝硬化,急性重癥肝炎)與肝癌肝移植患者相比,有較低的肝移植后乙肝復(fù)發(fā)率(p=0.003)。而其他臨床指標(biāo)則與肝移植后乙肝復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)。
　　 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定Toll樣受體家族的41個(gè)Tag SNPs位點(diǎn)。其最小等位基因頻率與人類基因組計(jì)劃中中國(guó)北京人的

8、最小等位基因頻率大致相同。各個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡。連鎖不平衡情況也與人類基因組計(jì)劃類似。通過(guò)對(duì)41個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性和肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的情況比較后我們發(fā)現(xiàn)在位點(diǎn)rs11536889基因型與肝移植后乙肝復(fù)發(fā)密切相關(guān)。C-G基因型和G-G基因型跟C-C基因型相比,肝移植后乙肝復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)明顯降低。同樣,41個(gè)位點(diǎn)上的等位基因頻率也和肝移植后乙肝復(fù)發(fā)進(jìn)行了對(duì)比,發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs11536889和rs2159377等位基因頻率

9、與肝移植后乙肝復(fù)發(fā)相關(guān)。但經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后只有位點(diǎn)rs11536889基因型與肝移植后乙肝復(fù)發(fā)依然存在相關(guān)性(p=0.041)。在TLR1-6和TLR10基因上按照頻率大于0.1構(gòu)建單倍型。經(jīng)過(guò)肝移植后乙肝復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者中Toll樣受體家族基因單倍型比較未發(fā)現(xiàn)有單倍型和肝移植后乙肝復(fù)發(fā)相關(guān)(p＞0.05)。將肝移植后乙肝復(fù)發(fā)相關(guān)因素位點(diǎn)rs11536889基因型和肝移植病因納入多因素分析,結(jié)果顯示兩者均可作為獨(dú)立的相關(guān)因