PKC-,γ--NMDAR1在硝酸甘油致偏頭痛大鼠發(fā)病機(jī)制中的作用探討.pdf

1、偏頭痛是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）功能紊亂性疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和工作。目前偏頭痛的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。隨著神經(jīng)生物、分子藥理學(xué)的發(fā)展及腦成像技術(shù)的應(yīng)用，中樞高敏感性在偏頭痛發(fā)作中的作用為人們所重視。目前有許多研究在脊髓水平上表明了外周炎癥性疼痛、神經(jīng)源性疼痛所致中樞高敏感性由PKC-NMDAR環(huán)路介導(dǎo)。 蛋白激酶C（PKC）為絲氨酸/蘇氨酸激酶大家族成員，是一類Ca2+

2、、磷脂依賴性磷酸化酶，作為一種胞內(nèi)第二信使，PKC在神經(jīng)元興奮性的調(diào)制、信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性等中起重要作用。其中PKCγ亞單位為腦、脊髓所獨(dú)有，在疼痛信號(hào)處理及中樞敏感化誘導(dǎo)和維持中起重要作用。 N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體的一種類型，屬于離子型受體。NMDAR有NR1，NR2，NR3等三種亞單位，NMDAR是由NR1和NR2或NR3組成的異聚體，其中NR1是必需的

3、組分，NR2，NR3則修飾了整個(gè)受體的功能特性。它涉及了體內(nèi)許多復(fù)雜的生理和病理過(guò)程，包括wind-up，中樞敏化、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、外周敏化和內(nèi)臟疼痛、細(xì)胞壞死和凋亡，除此以外，還參與了痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持。 研究表明，當(dāng)興奮性沖動(dòng)傳來(lái)時(shí)，突觸前膜釋放大量的興奮性氨基酸（EAAs），使突觸后膜產(chǎn)生快EPSP，導(dǎo)致NMDAR通道內(nèi)的阻止Ca2+內(nèi)流的Mg2+移開(kāi)，Ca2+得以內(nèi)流，激活了胞內(nèi)Ca2+依賴的PKC，促使PKC的膜轉(zhuǎn)位，磷

4、酸化胞膜上的NMDAR相關(guān)的離子通道，減少M(fèi)g2+對(duì)NMDAR通道的阻斷作用，最終使NMDAR活性增高、更多的Ca2+內(nèi)流入胞，進(jìn)一步增強(qiáng)PKC活性及其對(duì)NMDAR通道的效應(yīng)，這一PKC-NMDAR正反饋環(huán)路在中樞敏感化中具有重要作用。 氟桂利嗪是一種長(zhǎng)效的鈣離子拮抗劑，被公認(rèn)為是預(yù)防偏頭痛的一線藥物。臨床雙盲對(duì)照研究表明，該藥可以有效減少偏頭痛發(fā)作的頻率及頭痛的嚴(yán)重程度，但氟桂利嗪預(yù)防偏頭痛發(fā)作的機(jī)制目前不明。 目的：

5、 本研究將從PKCγ、NMDAR1、磷酸化NMDAR1著手，首先建立硝酸甘油型實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，并同步設(shè)立生理鹽水對(duì)照組及氟桂利嗪干預(yù)組，檢測(cè)腦干組織中上述各物質(zhì)mRNA及其蛋白的表達(dá)，并比較它們?cè)诎l(fā)作期與間歇期的表達(dá)變化，以初步探討PKGγ、NMDAR1、磷酸化NMDAR1在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 1.動(dòng)物分組及處理：采用清潔級(jí)成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為3組

6、。模型組：依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg，每周1次，共5周，制作實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，并于第二次造模后給予生理鹽水10ml/kg/d灌胃，共4周；對(duì)照組：與模型組同步對(duì)照，以生理鹽水代替硝酸甘油皮下注射；干預(yù)組：自硝酸甘油第二次造模后，給予氟桂利嗪5mg/kg/d灌胃，共4周。 2.受試動(dòng)物于第5次造模后2小時(shí)（發(fā)作期）或第4天（間歇期）分別斷頭處死，取大鼠腦干組織，液氮內(nèi)保存。 3.RT-PCR

7、法半定量檢測(cè)大鼠腦干組織PKCγ、NMDAR1mRNA的表達(dá)。 4.Western-Blot法檢測(cè)大鼠腦干組織PKCγ、NMDAR1、磷酸化NMDAR1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1.與對(duì)照組相比，在偏頭痛發(fā)作期及間歇期，模型組和干預(yù)組大鼠的腦干組織中PKCγmRNA及蛋白的表達(dá)無(wú)變化（p>0.05）； 2.與對(duì)照組相比，在偏頭痛發(fā)作期及間歇期，模型組和干預(yù)組大鼠的腦干組織中NMDAR1mRNA及非磷酸化蛋白的表

8、達(dá)無(wú)變化（p>0.05）； 3.與對(duì)照組相比，模型組磷酸化NMDAR1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（p<0.05），干預(yù)組也稍有上調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；模型組發(fā)作期與間歇期之間，干預(yù)組發(fā)作期和間歇期之間，磷酸化NMDAR1蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化（p>0.05）。 結(jié)論 1、偏頭痛的發(fā)生發(fā)展可能與PKCγ依賴的磷酸化NMDAR1蛋白表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。而可能與PKCγmRNA及蛋白、NMDAR1mRNA及蛋白（非磷