梨自交親和性變異的分子機理研究.pdf

1、本文以奧嗄二十世紀、金墜梨及大果黃花3個自交親和性突變品種為試材，應用現(xiàn)代分子生物技術等手段，研究了突變品種及其原始品種授粉生物學特性、S-RNase基因型、S-RNase基因的表達以及在后代中的分離規(guī)律等，主要的結果如下：
　　 1.奧嗄二十世紀自交親和性突變的分子機制
　　 田間授粉結果表明奧嗄二十世紀及其后代秋榮和54S-135自花授粉能夠結實，座果率達88％以上，為自交親和性品種，而它的原始品種二十世紀自花授粉結

2、實率低，僅有7％，表現(xiàn)自交不親和性。而在相互授粉時，奧嗄二十世紀雌蕊接受二十世紀和54S-135的花粉而受精結實，但二十世紀雌蕊拒絕奧嗄二十世紀和54S-135的花粉，證實奧嗄二十世紀僅是雌蕊發(fā)生自交親和性突變（S2S4SM，SM=stylar-part mutant，花柱突變體），花粉與其原始品種一樣，自交不親和性功能正常。
　　 PCR檢測供試品種花柱S-RNase基因的結果顯示，奧嗄二十世紀的花柱S2-RNase基因與其原

3、始品種二十世紀完全一樣，而S4-RNase基因比其原始品種二十世紀的少，并在花柱中正常轉錄；而且，IEF-PAGE也檢測到奧嗄二十世紀花柱中微量的S4-RNase蛋白，并且在柱頭上的表達量與二十世紀的無明顯差異，表明S4-RNase基因確實在奧嗄二十世紀基因組中存在并在柱頭上正常表達。但是在其后代基因組中不能檢測到S4-RNase基因，也不能檢測到S4-RNase mRNA和S4-RNase蛋白，表明奧嗄二十世紀中少量的花柱S4-RNa

4、se基因不能遺傳給后代。從奧嗄二十世紀的自交后代中S-Rase基因的分離特性來看，S2S4SM和S4SMS4SM分離比例為1:1，從分子水平印證了與前人的結果。
　　 本研究的結果認為奧嗄二十世紀含有少量的S4-RNase基因，并在柱頭上正常表達，但是不能遺傳給后代，含有S4SM等位基因的后代S4-RNase基因缺失，表現(xiàn)自交親和。
　　 2.金墜梨自花授粉結實的機制
　　 田間授粉試驗結果顯示，鴨梨自花結實率僅

5、2％，自花花粉管在花柱中上部已經(jīng)停止生長，而金墜梨自花結實率高達76％，自花花粉能正常生長至花柱基部：相互授粉時發(fā)現(xiàn)，鴨梨花柱能夠接收金墜梨花粉并受精結實，而金墜梨花柱卻與鴨梨花粉雜交不親和。這些結果初步表明金墜花柱自交不親和性功能正常，而花粉發(fā)生變異。
　　 鴨梨和金墜梨基于S-RNase基因的S基因型完全一致，均為S21S34；進一步克隆兩品種S-RNase基因cDNA全長序列，并進行比較分析。結果顯示，該兩品種的1對雌蕊S

6、-RNase基因在核苷酸序列上完全相同；RT-PCR分析結果表明，兩個品種的1對S-RNase基因均正常表達，表達量也沒有明顯差異，從分子水平上證實了金墜梨在花柱方面和鴨梨并無差異，而是花粉自交不親和性功能發(fā)生變異，導致了自交不親和性功能的喪失，表現(xiàn)出自花授粉能夠結實。
　　 進一步分析金墜梨自交后代中S-RNase基因的分布，結果顯示，在17個后代中均能檢測出S34-RNase基因，但是只在8個后代中檢測到S21-RNase基

7、因，因此這8個后代居于S-RNase的S基因型與其親本一樣為雜合體S21S34，而其余的9個后代則為S34純合體，即S34S34，而沒有發(fā)現(xiàn)S21S21純合體后代，S21S34：S34S34=8:9≈1:1。該結果表明，金墜梨的S21單元型花粉SI功能正常，只有S34單元型花粉發(fā)生變異，因而其S單元型應該為S21S34PPM（PPM=pollen-part mutant，花粉突變體），但S34單元型花粉究竟究竟是如何突變，是由于兩個S單

8、元型花粉S基因發(fā)生異源二倍體化，即單個花粉中包含兩個不同S單元型的花粉S基因，從而因“競爭型相互抑制”導致自交親和，還是因花粉S基因本身發(fā)生變異引起自交親和，需要等梨花粉S基因鑒定出來后，通過比較分析鴨梨和金墜梨兩者花粉S基因是否有差異，才能解開金墜梨自交親和性突變之謎，但決不是因染色體倍性的改變導致自交親和。
　　 3.大果黃花的自花授粉結實的機制
　　 田間授粉試驗結果顯示，黃花梨自花授粉結實率僅為1.5％，屬于自交

9、不親和性品種；而大果黃花自花授粉的結實率高達60％，屬于自交親和性品種；相互授粉時，黃花×大果黃花組合的坐果率達70％，為雜交親和，但反交時坐果率為1％，表現(xiàn)為雜交不親和；熒光顯微鏡觀察這些組合授粉后花柱內花粉管生長情況，也得到相同的結果。這些結果表明，大果黃花雌蕊的自交不親和性性狀正常，但花粉發(fā)生突變。
　　 進一步鑒定出了黃花和大果黃花基于S-RNase基因的S基因型，發(fā)現(xiàn)兩者一樣，均含有S1-RNase和S2-RNase基

10、因；該兩品種的這1對雌蕊S-RNase基因的DNA序列沒有差異，而且均是特異性地在花柱中表達，表達量也沒有明顯差異，表明大果黃花和黃花的花柱S-RNase基因并無差異，雌蕊自交不親和性功能均正常。
　　 染色體數(shù)目觀察結果顯示大果黃花有68條染色體，而它的原始品種黃花含有正常的34條染色體，表明大果黃花為黃花的四倍體芽變，因而S基因型應該為S1S1S2S2。
　　 進一步調查大果黃花自交后代S基因型，未發(fā)現(xiàn)S1S1S1S

11、1和S2S2S2S2的純和體后代，S1S1S1S2、S1S1S2S2和S1S2S2S2分離比例為6:15:6≈1:2:1，表明只有雜合二倍體花粉（S1S2）才能克服自交不親和性，而純合二倍體花粉（S1S1和S2S2）仍然表現(xiàn)正常的自交不親和性，同時也表明兩個花粉S基因本身正常。
　　 所有這些證據(jù)表明，大果黃花的自交親和性變異，是因染色體數(shù)目加倍而產(chǎn)生雜合二倍體花粉，進而導致了花粉自交不親和性功能的喪失，表現(xiàn)出自花授粉能夠結實，

12、但花柱自交不親和性功能以及花粉S基因本身正常。
　　 本研究結果進一步闡明了雌蕊自交親和性突變品種奧嗄二十世紀S4-RNase基因的特性，首次澄清了國際上多年懸而未決的關于奧嗄二十世紀自交親和性突變的分子和遺傳機制，即S4-RNase基因以嵌合體的形式，但不能傳給后代。同時首次以兩個梨花粉自交親和性突變品種為試材，發(fā)現(xiàn)兩者雖然表型一致（即均是花粉SI功能喪失），但應用兩種不同的策略打破自交不親和性，即大果黃花通過染色體加倍，產(chǎn)生