無指盤臭蛙和山溪鯢皮膚及卵中3種生物活性多肽的分離鑒定和克隆.pdf

1、兩棲類動物屬于一類可持續(xù)利用的自然資源，它們具有多種多樣的科研及利用價(jià)值。此外，它們的組織中含有大量的分子結(jié)構(gòu)特殊、功能復(fù)雜多樣的生物活性物質(zhì)，它們是有待于開發(fā)的資源寶庫。中國擁有豐富的兩棲類動物資源，共有284個(gè)種(亞種)，其中2／3是特有種類，它是我國生物資源的重要組成部分，也是人類的寶貴財(cái)富，對我國兩棲類動物資源的開發(fā)利用有很大的潛力。目前，已分離鑒定出許多具有各種生物活性的蛋白及多肽。 我們收集分布于中國西南境內(nèi)的2種常

2、見的藥用、食用兩棲類：山溪鯢(Batrachuperus pachunii)及無指盤臭蛙(Rana grahami)，并對這2種兩棲類皮膚分泌液及其卵進(jìn)行了如下一系列的生物活性篩選研究：(1)以發(fā)色底物對2種兩棲類動物皮膚分泌液進(jìn)行絲氨酸蛋白酶水解活性和絲氨酸蛋白酶抑制劑活性測定，山溪鯢皮膚分泌液無絲氨酸蛋白酶水解活性，無指盤臭蛙皮膚分泌液及卵勻漿液顯示較強(qiáng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性；(2)2種兩棲類皮膚分泌液具有較強(qiáng)的抗茵活性，而其卵勻

3、漿液則無明顯抗菌作用；(3)2種兩棲類的皮膚分泌液不具備出血活性，無指盤臭蛙卵勻漿液顯示較弱的溶血活性，而山溪鯢卵勻漿液無溶血活性。(4)2種兩棲類皮膚分泌液及其卵勻漿液對正常人血漿的復(fù)鈣時(shí)間沒有明顯的影響，即它們對正常人血液沒有明顯的促凝和抗凝作用。 進(jìn)一步通過生物化學(xué)，分子生物學(xué)手段和研究方法，分別從2種兩棲動物皮膚分泌液或卵勻漿液中，我們得到了3種生物活性多肽類或蛋白類物質(zhì)， 包括兩個(gè)抗菌肽、兩個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑及β-

4、microseminoprotein樣蛋白。并分別對這幾類活性多肽類或蛋白類物質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。 通過S印hadex G-50凝膠過濾、反相高壓液相等生化技術(shù)手段，從無指盤臭蛙皮膚分泌液中得到兩個(gè)具有廣譜抗菌活性的抗菌肽。該兩個(gè)抗菌肽被命名grahamin 1 andgrahamin 2。Edman降解法測序結(jié)果grahaminl的氨基酸序列為GLLSGILGAGKNIVCGLSGLC；grahamin 2的氨基酸序列為GLL

5、SGILGAGKHIVCGLSGLC；快原子轟擊質(zhì)譜分析表明，grahamin l及grahamin 2的分子量分別為1942Da和1965Da，結(jié)果與理論分子量(1942.5Da和1965.6Da)基本相符。grahamin l及grahamin 2氨基酸序列比較分析顯示，兩個(gè)抗菌肽只有一個(gè)氨基酸殘基的差異，在他們的c-末端包含有蛙屬動物共有的Rana box區(qū)域；他們具有凈電荷、堿性氨基酸數(shù)目、疏水性等抗菌肽的典型特征。同源性比較顯

6、示，純化得到的兩個(gè)抗菌肽與來源于黑斑蛙皮膚分泌液的nigrocins有66％的同源性；利用測序得到的N-末端氨基酸序列并參照其他蛙類編碼抗菌肽的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，從無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫中克隆及篩選到兩個(gè)cDNA序列。由這兩個(gè)序列推導(dǎo)的氨基酸序列中包含了分離純化得到的兩個(gè)抗菌肽的氨基酸序列。綜合以上信息，grahamin 1及grahamin2屬于包含一個(gè)內(nèi)二硫鍵的單鏈抗菌肽家族。通過分子篩、離子交換層析及反相高壓液相色譜等分離純

7、化程序，從無指盤臭蛙卵的勻漿液中得到了兩個(gè)表觀分子量約為40kDa和14.4KDa的單鏈蛋白。它們分別被命名為RGETI-1和RGETI-2。RGETI-1對胰蛋白酶具有專一性的抑制活性，對胰蛋白酶的抑制常數(shù)為29.5nM。測得RGETI-1的N-末端部分氨基酸序列為KDRACKLSPDVGPCKAYMQRC。經(jīng)BLAST搜尋比對，該蛋白與來源于加蓬灣蝮蛇(Bitis gabonica)蛇毒腺液及棕色狗蜱(Rhipicephalus s

8、anguineus)唾液腺的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑分別有57％和87％的同源性，該蛋白的12～15氨基酸殘基位點(diǎn)與典型的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑活性中心完全相同。結(jié)合其N-末端氨基酸序列BLAST搜尋結(jié)果及性質(zhì)，推測該蛋白屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。RGETI-2對胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶及彈性蛋白酶具有抑制活性；對這三類酶的抑制常數(shù)分別為0.24uM、4.4nM和0.637uM。酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性分析

9、顯示，RGETI-1和RGETI-2在PH2-11及30℃-100℃的條件下，均能保持抑制劑活性，顯示其潛在的應(yīng)用價(jià)值。 從山溪鯢(Batrachuperus pachunii)皮膚勻漿液中經(jīng)過Sephadex G-50凝膠過濾、AKTA<'〇R> Resource Q陰離子柱和反向高壓液相C<,4>柱，分離純化得到一個(gè)表觀分子量為12kDa的小分子蛋白。利用其N-末端氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，從山溪鯢皮膚cDNA中克隆及篩選到該蛋白

10、的cDNA序列。該cDNA序列的開放閱讀框?yàn)?42bp，編碼113個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。經(jīng)BAST數(shù)據(jù)庫搜尋比對分析表明，該蛋白的氨基酸序列與來自人類及其他哺乳動物β-microseminoprotein蛋白具有約40％的序列同源性。這也是首次在動物皮膚中確認(rèn)β-microseminoprotein。初級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白屬于親水性蛋白；多重序列比較顯示，其氨基酸序列中的10個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)及15個(gè)其他氨基酸位點(diǎn)與高等脊椎動物β-mi