海蛙(Fejervarya cancrivora)皮膚分泌液中抗菌多肽的分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、兩棲類動(dòng)物皮膚是生物活性物質(zhì)豐富的資源庫(kù)，其皮膚中含有的生物活性物質(zhì)種類繁多、功能復(fù)雜，這些活性物質(zhì)可用來(lái)保護(hù)機(jī)體抵御有害環(huán)境因子的侵襲。迄今為止，已從兩棲類動(dòng)物皮膚中分離鑒定出許多具有不同生物活性的蛋白以及多肽。海蛙作為唯一能在海水中生活的兩棲類動(dòng)物，由于特殊的生活環(huán)境，其生理調(diào)節(jié)機(jī)制和生物活性物質(zhì)必定和淡水蛙有所不同，到目前為止未有關(guān)于海蛙活性物質(zhì)的報(bào)道。本論文以海蛙(Fejervarya cancrivora)為試驗(yàn)材料，對(duì)其皮膚

2、分泌液中抗菌肽進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)和功能的研究。
　　 通過(guò)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析和反相高壓液相層析（RP-HPLC）的分離純化，從海蛙皮膚分泌物中分離到3種抗菌肽，其序列分別是GSAQPYKQLHKvvNWDPYG、RVCSAIPLPICH和RVCMAIPLPLCH，這是第一次關(guān)于海蛙抗菌肽的報(bào)道。其中一個(gè)由19個(gè)氨基酸殘基組成，不合有半胱氨酸，結(jié)構(gòu)中富含雜環(huán)氨基酸和堿性氨基酸，整個(gè)分子帶正電荷，通過(guò)同源性比對(duì)發(fā)

3、現(xiàn)，它與大多數(shù)蛙科來(lái)源的抗菌肽不同，和目前已知的任何蛋白沒(méi)有顯著的相似性，是一個(gè)嶄新的抗菌肽家族，將其命名為cancrin。另外兩個(gè)12個(gè)氨基酸組成的多肽和目前僅在虎紋蛙中發(fā)現(xiàn)的tigerinin-2抗菌肽類似，存在1～2個(gè)氨基酸的差異，結(jié)構(gòu)中兩個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵形成一個(gè)九肽環(huán)，因含有多個(gè)堿性氨基酸殘基而使整個(gè)分子帶正電荷，將其命名為tigerinin-RCl和tigerinin-RC2。
　　 用海蛙皮膚中提取的mRNA為

4、材料，建立了海蛙皮膚的cDNA文庫(kù)。根據(jù)設(shè)計(jì)的抗菌肽引物，從海蛙皮膚cDNA文庫(kù)中克隆抗菌肽的編碼基因，共篩選出22個(gè)陽(yáng)性克隆.測(cè)序結(jié)果表明，上述22個(gè)基因編碼17個(gè)不同的抗菌肽前體.進(jìn)一步分析這17條基因后發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼4個(gè)不同的成熟肽cancrin A1、cancrin A2、tigerinin-RCl以及tigerinin-RC2，將其分別歸屬于cancrin和tigerinin抗菌肽家族.cancrin家族的前體蛋白有68個(gè)

5、氨基酸殘基組成，包括22個(gè)殘基組成的信號(hào)肽區(qū)域和由19個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽cancrin A1和cancrin A2。 tigerinin-RC前體蛋白有71個(gè)氨基酸殘基組成，包括22個(gè)殘基組成的信號(hào)肽和由12個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽tigerinin-RCl和tigerinin-RC2，這也是關(guān)于編碼tigerinin抗菌肽家族的基因序列的第一次報(bào)道.這兩個(gè)抗菌肽家族的整體結(jié)構(gòu)均由三部分組成：信號(hào)肽-間隔肽-成熟肽。信號(hào)肽和Ran

6、a科抗菌肽家族的信號(hào)肽類似，比較保守；間隔肽是由以KR酶切位點(diǎn)結(jié)束的酸性肽組成；成熟肽則具有抗菌肽的典型特征，含有多個(gè)堿性氨基酸，整個(gè)區(qū)域帶正凈電荷；整體結(jié)構(gòu)和其他兩棲類物種中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽很相似，所不同的是海蛙這兩個(gè)抗菌肽家族的成熟肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和其他兩棲類抗菌肽的結(jié)構(gòu)差異很大。根據(jù)tigerinin和cancrin前體結(jié)構(gòu)與蛙科抗菌肽前體序列的相似性，我們推測(cè)這類抗菌肽可能來(lái)自同一祖先，長(zhǎng)期的自然選擇使它們共同的祖先基因發(fā)生了分化，進(jìn)化

7、出不同的功能和防御機(jī)制。對(duì)這三個(gè)區(qū)域氨基酸的同義突變和錯(cuò)義突變的分析表明，各區(qū)域的同義突變突變速率基本相同，信號(hào)肽和間隔肽的基因中非同義替代的速率高于同義替代，成熟肽中非同義替代的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同義替代。這種從信號(hào)肽，到間隔肽，再到成熟肽，錯(cuò)義突變速率越來(lái)越低的現(xiàn)象，成熟肽區(qū)域密碼子的突變特征符合新達(dá)爾文進(jìn)化理論中凈化選擇的現(xiàn)象，推測(cè)這個(gè)家族的抗菌肽在海蛙體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能。
　　 以大腸桿菌（Escherichia coli,

8、 E.coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis, B.subtilis），白色念珠菌(Candida albicans, C.albicans)，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa, P.aeruginosa)為測(cè)試菌株，研究cancrin、tigerinin-RCl和tigerinin-RC2的抗菌活性，分析結(jié)果表

9、明，它們均具有廣譜、有效的抗菌活性.Cancrin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus和B.subtilis、真菌 C.albicans具有較強(qiáng)的殺滅作用，其中對(duì)S.aureus ATCC25923作用最強(qiáng)，MIC為15μ g·ml-1；但cancrin對(duì)革蘭氏陰性菌E.coli ATCC25922作用較弱，樣品濃度為120ug· ml-1時(shí)抑菌效果仍不明顯，而tigerinin家族的抗菌譜和抗菌活性比cancrin要強(qiáng)，除對(duì)上述菌株有效外，

10、還對(duì)P.aeruginosa有效，其MIC為10μg· ml-1。
　　 對(duì)這兩個(gè)抗菌肽家族的毒性試驗(yàn)表明，它們對(duì)兔紅細(xì)胞的裂解能力都比較弱，溶血活性不強(qiáng)，表明它們對(duì)真核細(xì)胞的毒性較低，這對(duì)于它們進(jìn)一步用于臨床提供了很好的前提條件.
　　 對(duì)cancrin抗菌肽的功能研究表明，它不具有促進(jìn)肥大細(xì)胞脫粒、促或抗組胺釋放功能，沒(méi)有檢測(cè)出絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性和紅細(xì)胞凝集的活性，但具有抗氧化活性，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的自由基清除能力.