棕點湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、兩棲類是一類具有生態(tài)、科研、經(jīng)濟、以及文化價值的自然資源。同時，兩棲類皮膚也是具有很大開發(fā)潛力的生物資源寶庫。兩棲類的皮膚中含有種類繁多、功能復雜的生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可用來抵御有害環(huán)境因子的侵襲。存在于兩棲類皮膚分泌液中的生物活性成分引起了世界上研究人員極大的關(guān)注。迄今為止，已分離鑒定出許多具有各種生物活性的蛋白以及多肽。中國擁有豐富的兩棲類資源，在284個種(亞種)中2/3是特有種，在生物活性物質(zhì)開發(fā)方面具有極大的潛力。我們收

2、集了三種兩棲類動物：棕點湍蛙(Amolops loloensis)、無指盤臭蛙(Ranagrahami)以及中國林蛙(Rana chensinensis)，并對這三種兩棲類的皮膚分泌液進行了一系列的生物活性篩選：1.胰蛋白酶水解活性檢測；2.胰蛋白酶抑制劑活性檢測；3.抗菌活性檢測；4.溶血、出血及血漿凝固活性檢測；5.血小板聚集活性檢測；6.血小板聚集抑制活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有胰蛋白酶水解活性；2.棕點

3、湍蛙以及無指盤臭蛙皮膚分泌液具有較強的胰蛋白酶抑制劑活性；3.棕點湍蛙以及無指盤臭蛙皮膚分泌液具有較強的抗菌活性；4.三種兩棲類的皮膚分泌液不具備出血活性，但是顯示較弱的溶血活性以及抗血漿凝固活性。5.三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有促進血小板聚集活性；6.棕點湍蛙皮膚分泌液具有抑制血小板聚集活性。以來源于單個棕點湍蛙(Amolops loloensis)個體皮膚中提取的mRNA為材料，我們建立了棕點湍蛙皮膚cDNA文庫，得到大約為1×1

4、0<'6>個獨立的克隆。通過生物化學，分子生物學手段和研究方法，在棕點湍蛙皮膚分泌液中得到一系列的皮膚活性多肽以及cDNA序列，其中包括抗茵肽，緩激肽，胸腺肽等，并對其結(jié)構(gòu)，功能進行了相應的研究。通過兩步分離純化過程：Sephadex G-50凝膠過濾和反相高壓液相層析(RP-HPLC)，我們從棕點湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到3個、2類別的抗菌肽，并命名為amolopin-1a，1b和1c。借助于質(zhì)譜，我們得到這三個抗茵肽的分子量分別為

5、2665.3、2663.7和1626.0道爾頓。這兩類抗菌肽都含有多個堿性氨基酸而帶有正電荷，這是首次從湍蛙屬中分離純化得到的抗菌肽，進一步豐富了兩棲類抗茵肽類群。我們所得到的3個抗菌肽，其中2個由24個氨基酸殘基組成，具有半胱氨酸組成的二硫鍵，形成Rana box。通過Genbank進行blast，發(fā)現(xiàn)該類抗菌肽與來源于Rana esculenta的brevinin-1E具有87％和79％的同源性。另外一個抗菌肽由16個氨基酸殘基組成

6、，不含有半胱氨酸組成的二硫鍵，可以形成a-螺旋。這類抗茵肽和來源于Rana temporaria的Temporin-F具有50％的同源性。根據(jù)一系列的活性檢測，我們發(fā)現(xiàn)兩類amolopin抗菌肽在一些活性上具有很大的差異。amolopin-1b具有很強的溶血活性和較弱的肥大細胞脫粒肽活性，而amolopin-2a則相反，但是兩者都有較強的促進肥大細胞中組胺釋放的活性。amolopin-1b和2a都具有一定的抗腫瘤活性。根據(jù)編碼Rana

7、esculenta中brevinin-1E前體保守的5’端核苷酸區(qū)域設(shè)計引物，在棕點湍蛙皮膚cDNA文庫中篩選編碼amolopin抗茵肽的cDNA序列的單克隆。對所得到的陽性克隆進行測序，我們篩選到編碼不同amolpin抗菌肽前體的不同的cDNA序列14條，這14條cDNA序列最終編碼3類、8條不同的amolopin抗菌肽。我們將這三類抗菌肽命名為amolopin-1，2，3系列。通過兩步分離純化過程：Sephadex G-50凝膠過濾

8、和反相高壓液相層析(RP-HPLC)，從棕點湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到一種具有12個氨基酸的緩激肽，我們將該緩激肽命名為amolopkinin。該緩激肽和來源于Rana rugosa的ranakinin R具有76％的同源性，具有增強小鼠回腸肌收縮的作用。amolopkinin在N端部分具有插入片段APV，這是首次從湍蛙屬得到的緩激肽以及cDNA序列。 通過隨機篩選棕點湍蛙cDNA文庫，我們得到了棕點湍蛙胸腺肽-β<,4>的c