桑黃多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性的研究.pdf

1、桑黃(Phellinus igniarius)是一種珍貴的藥用真菌，含有多種化學(xué)成分，其中最主要的是多糖。近年來的研究表明，桑黃多糖具有抗腫瘤及其它多種生物功能，但目前的研究大多是用野生或發(fā)酵的桑黃提取物或粗多糖做研究對象，對人工栽培的桑黃及其多糖的結(jié)構(gòu)和純多糖活性的研究甚少。本論文對人工栽培桑黃中的多糖進(jìn)行了分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的系統(tǒng)研究，對開發(fā)利用我國的珍稀藥用菌資源具有重要的學(xué)術(shù)意義，對桑黃天然抗腫瘤藥物的開發(fā)也具有一定的

2、應(yīng)用價值。 首先對桑黃子實體多糖進(jìn)行了分離純化，通過熱水提取、乙醇分級沉淀分離得到粗多糖PIP30、PIP60和PIP80，通過超濾分離得到粗多糖PIWE1-10、PIWE10-100和PIWE100；6種粗多糖經(jīng)體外刺激淋巴細(xì)胞增殖實驗表明均有體外刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用。PIP30經(jīng)陰離子交換層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)得到分級多糖P30U、P30W、P30S1和P30S2，PIP60經(jīng)陰離子交換層

3、析得到分級多糖P60U、P60W、P60S1和P60S2，PIWE1-10經(jīng)陰離子交換層析得到分級多糖P1W、P1S1和P1S2，PIWE10-100經(jīng)陰離子交換層析得到分級多糖P10W、P10S1和P10S2，PIWE100經(jīng)陰離子交換層析得到分級多糖P100U、P100W、P100S1和P100S2；采用體外刺激淋巴細(xì)胞增殖實驗對離子柱分級分離的多糖進(jìn)行活性實驗表明P30U、P30W、P30S1、P30S2、P60U、P60W、P6

4、0S2、P1S1、P1S2、P10S1、P10S2、P100U、P100W、P100S1和P100S2是有活性的。P60W、P60S1、P1S1、P10S1和P100S1經(jīng)凝膠柱(Sephacryl s系列材料)層析獲得五個純多糖組分P60w1、P60s1、P1SP1、P10SP1和P100SP1。經(jīng)高效液相色譜檢測均為單一對稱峰，說明五種多糖都是均一組分，紫外全掃描顯示不含蛋白質(zhì)和核酸特征吸收，紅外光譜檢測都含有糖的特征性基團(tuán)，其相對

5、分子量分別為1.71×10<'4>、2.07×10<'4>、1.48×10<'4>、2.20×10<'4>和2.56×10<'4>其中P60w1、P1SPl、P10SP1和P100SP1有體外刺激淋巴細(xì)胞增殖作用的活性。 運用離子色譜、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析及相關(guān)的化學(xué)方法相結(jié)合對桑黃多糖中的單糖組分3-O-甲基-半乳糖進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)桑黃．Phellinus igniarius子實體分離的各純多糖和發(fā)酵菌絲體多糖的糖組成中均包

6、含3-O-甲基-半乳糖，而在其它藥用真菌中尚無此單糖組成的報道，說明它可能是桑黃菌Phellinus igniarius多糖中含有的一種不同于其它藥用真菌的特征性單糖。 通過單糖組成分析、甲基化分析、核磁共振(<'1>H NMR．<'13>C NMR，<'1>H-<'1>H COSY譜、TOCSY譜、HMQC譜、NOESY譜和HMBC譜)技術(shù)，對分離純化得到的5個均一多糖的糖殘基個數(shù)、糖殘基的連接方式、構(gòu)型、連接順序等進(jìn)行了研究

7、。重點解析了活性較好、得率較高的均一多糖P60w1的結(jié)構(gòu)，闡明P60w1的單糖組成有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和3-O-甲基-半乳糖，摩爾比為：1.12:2.26:1.00:1.03:1.11，主鏈主要是由α-(1→6)-D-半乳糖、α-(1→2,6)-3-O-甲基-D-半乳糖、β-(1→2,4)-3-O-甲基-D-半乳糖和α-(1→2,6)-D-甘露糖構(gòu)成，側(cè)鏈由α-端基L-巖藻糖和α-端基D-葡萄糖構(gòu)成，其一級結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元如下

8、式，目前尚無該多糖結(jié)構(gòu)的研究報道。 對其它四種均一多糖的結(jié)構(gòu)分析表明，其糖組成中均包含巖藻糖、3-O-甲基-半乳糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖，其中3-O-甲基-半乳糖和半乳糖占的比例較大，可能存在于主鏈上，木糖和阿拉伯糖占的比例較小：半乳糖有1，6和1，2,6兩種連接方式，以1，6連接為主，巖藻糖主要以端基的形式存在；組成幾種均一多糖的單糖的比例不同，葡萄糖和甘露糖在不同的多糖中連接方式有所不同。 對桑黃醇

9、提物PIEE、粗多糖PIP60、離子柱分離多糖P60S2和純多糖P60w1進(jìn)行了體外和體內(nèi)的抗腫瘤實驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIEE、PIP60、P60S2和P60w1對小鼠肝癌H22均有顯著抑制作用，其中純多糖P60wl的效果最好，優(yōu)于陽性對照云芝糖肽；P60w1和P60S2對小鼠Lewis肺癌均有抑制作用，效果均優(yōu)于陽性對照云芝糖肽，有效作用劑量為100 mg/(kg-d)。通過體外抑制腫瘤細(xì)胞生長試驗研究發(fā)現(xiàn)，桑黃純多糖在體外無抑制腫瘤細(xì)