乳酸脫氫酶抗體對大鼠血管源性腦水腫的保護(hù).pdf

1、研究背景及目的 腦水腫是神經(jīng)科及各種危重患者常見的一種病變，是患者致死、致殘的重要原因，也是腦血管病、顱內(nèi)占位性病變、顱腦損傷和炎癥等引起神經(jīng)功能障礙的主要病理生理改變之一。腦水腫的發(fā)病機(jī)制與血腦屏障(Blood-BrainBarrier，BBB)功能損害和腦細(xì)胞代謝紊亂關(guān)系最為密切。其中血管源性腦水腫(VasogenicBrainEdema，VBE)是最常見的腦水腫類型，其特點是：(1)水腫以白質(zhì)為主，其中星形細(xì)胞變化最明顯；

2、(2)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增高，BBB破壞；(3)水腫液富含蛋白，吸收緩慢，所以持續(xù)時間長，死亡率高。VBE的發(fā)病機(jī)理和治療是多年來國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究亟待解決的重大難題。盡管對VBE的發(fā)病機(jī)理有多種學(xué)說，如微循環(huán)學(xué)說、鈉泵學(xué)說、興奮性氨基酸學(xué)說、能量衰竭學(xué)說、自由基學(xué)說、鈣通道學(xué)說等，但很難根據(jù)單一學(xué)說制出VBE的模型或闡明其發(fā)生機(jī)制。 BBB是血液與神經(jīng)實質(zhì)之間限制某些物質(zhì)進(jìn)出腦組織的調(diào)節(jié)界面，由毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜和包圍毛

3、細(xì)血管的星形膠質(zhì)突起所成的神經(jīng)膠質(zhì)膜三種成分所組成，它不僅有機(jī)械性屏障保護(hù)作用，且能有選擇地將腦內(nèi)過剩物質(zhì)泵出腦外，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理平衡，保持腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。BBB解剖結(jié)構(gòu)的主要特征是“緊密連結(jié)”，在腦毛細(xì)血管細(xì)胞間，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞頂部以“緊密連結(jié)”結(jié)合的部位，像一層連結(jié)膜層。離子、蛋白質(zhì)和大的脂溶性非電解質(zhì)等主要經(jīng)細(xì)胞間通過的物質(zhì)大部分被“緊密連結(jié)”阻擋。在生理條件下，BBB嚴(yán)格控制水溶性物質(zhì)從血液到腦和從腦到血液的轉(zhuǎn)運(yùn)。在由于

4、全身或局部因素造成的腦缺氧、缺血、中毒或代謝障礙等病理情況下，腦毛細(xì)血管壁BBB功能迅速減弱甚至消失，某些不易滲入正常腦組織的物質(zhì)易于透入，腦細(xì)胞外蛋白及鈉離子均增加，局部滲透壓升高，致水分大量滲入并貯留在細(xì)胞外間隙，引起以細(xì)胞外白質(zhì)水腫為主的VBE。 在構(gòu)成BBB的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在著豐富而獨特的酶系統(tǒng)。國外有人觀察到某些藥物在透過毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞時可受酶的分解而失效。這些酶的作用物質(zhì)可以是機(jī)體內(nèi)正常的物質(zhì)，也可以是藥物、

5、毒物，可以是親水性物質(zhì)，也可以是親脂性物質(zhì)。由此我們提出了酶屏障的概念。酶屏障是指腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞上存在獨特的酶系統(tǒng)，能把相應(yīng)作用物質(zhì)降解，這些酶構(gòu)成一道屏障，對腦組織發(fā)揮保護(hù)作用，維持腦內(nèi)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，是BBB的重要組成部分。目前研究發(fā)現(xiàn)腦毛細(xì)血管及脈絡(luò)叢上皮的酶系統(tǒng)在維持BBB的功能及血與腦之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用，且酶的種類與腦實質(zhì)中不同。酶學(xué)研究提示在腦缺血、腦外傷及長期高血壓等病理情況下，這些酶的活

6、性往往發(fā)生改變，是BBB通透性改變引起VBE的重要原因之一，VBE早期大分子物質(zhì)及水分通過BBB的途徑很可能是與酶的保護(hù)性屏障作用破壞或酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用有關(guān)。由此認(rèn)為，在高血壓腦血管意外時，BBB通透性增高的一部分原因也是這些酶的活力增高，使BBB酶通道開放的結(jié)果。 目前腦水腫的常用治療藥物主要有以下幾種。1.高張溶液：最常用的是甘油果糖和甘露醇，甘油果糖有引起高鈉血癥和心力衰竭的副作用。此外甘油果糖還可能加重糖尿病及導(dǎo)致溶血。

7、甘露醇與甘油相比，雖然其起效快，但停藥后反跳現(xiàn)象和對腎臟的損害作用強(qiáng)。2.腎上腺皮質(zhì)類固醇制劑：類固醇制劑對腦腫瘤伴隨的血管源性腦水腫有效，但因有致消化道出血或易感染等副作用，所以只限于因某種原因不能使用高張溶液的情況下使用。3.自由基清除劑：主要包括酶類和非酶類，但酶制劑具有抗原性，易造成機(jī)體的免疫反應(yīng)。其次酶類在體內(nèi)的半衰期較短，不能長期存留發(fā)揮其作用。4.其他，包括鈣拮抗劑、神經(jīng)內(nèi)分泌治療、中醫(yī)中藥治療等。以上這些藥物雖然能在一定

8、程度上減輕VBE，但都沒有解決其發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)-BBB受損的問題，也不能對以白質(zhì)水腫為主要特征的VBE的腦白質(zhì)發(fā)揮特異性脫水作用，故治療效果不能令人滿意，且有一定的副作用。 VBE模型己有多年的研究歷史和多種制作方法，最為經(jīng)典且較為公認(rèn)的方法是腦局部冷凍法，但此法的致命弱點為與人類VBE的發(fā)病條件和環(huán)境截然不同，因而實驗結(jié)果與臨床實際情況不符。動脈夾閉法造成動脈供血區(qū)血流中斷，腦組織缺血缺氧，發(fā)生細(xì)胞毒性腦水腫，再灌流后的血

9、液成分通過壞死的血管壁漏出，與經(jīng)典的VBE概念有一定的距離。而且上述各方法皆為有創(chuàng)性實驗，造成實驗結(jié)果不精確，重復(fù)性差。我們用大鼠腹腔注射苯腎上腺素方法制成VBE模型。動物注藥后血壓急劇上升，出現(xiàn)高血壓腦病的癥狀。實驗證明用注射苯腎上腺素方法制成的VBE模型操作簡單、無創(chuàng)傷性、外界干擾少、重復(fù)性好。該模型以高血壓為VBE的誘發(fā)因素，符合臨床人類最多見的腦血管病發(fā)病情況,是一種較理想的、與人類發(fā)病條件相似的VBE模型。 研究表明在

10、腦卒中、腦瘤、腦外傷等伴發(fā)的腦水腫早期就可見腦脊液和腦組織中乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶等明顯升高。酶活性的增加，意味著物質(zhì)交換轉(zhuǎn)運(yùn)增加，一定程度上反映了BBB通透性的改變。腦是利用葡萄糖作為主要能源的器官，對糖代謝過程中血糖水平的變化十分敏感。VBE時LDH活性增高，可以認(rèn)為在高血壓腦水腫時糖酵解途徑增強(qiáng)。LDH活性一定范圍內(nèi)的升高可以提供腦代謝所需的能量。但隨著病變不斷發(fā)展，過度增強(qiáng)的活性則可使腦中無氧代謝產(chǎn)物堆積，進(jìn)一步加重腦

11、水腫。作者設(shè)想抑制這些酶活性，可減少血腦屏障通透性，從而減少腦水分含量，達(dá)到治療VBE的目的。 材料和方法 1大鼠血管源性腦水腫模型的制作 ①分組：40只清潔級Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組和腦水腫組每組20只。 每組取10只用于腦組織水分含量測定，其余20只用于腦毛細(xì)血管伊文思藍(lán)(Evensblue，EB)滲出量測定。②模型制備及給藥：用腹腔注射苯腎上腺素的方法制成VBE模型。正常組不注射苯腎上腺素及治

12、療藥物，直接斷頭取腦；腦水腫組制備模型后不給予治療藥物，即刻斷頭取腦，通過水分分析儀分別測定各組腦灰、白質(zhì)水分含量百分比。用EB測定血腦屏障的通透性。 2乳酸脫氫酶抗體對大鼠血管源性腦水腫的保護(hù) ①分組：60只清潔級Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、腦水腫組、腦水腫甘露醇組與腦水腫乳酸脫氫酶抗體(LDHAb)組，每組15只。每組取10只用于腦組織水分含量測定，其余5只用于腦毛細(xì)血管EB滲出量測定。②模型制備及給藥：用腹腔注

13、射苯腎上腺素的方法制成VBE模型。正常組不注射苯腎上腺素及治療藥物，直接斷頭取腦；腦水腫組制備模型后不給予治療藥物，即刻斷頭取腦；腦水腫甘露醇組在制成模型后由股靜脈注射甘露醇(20g/L，0.5g/kg)，30min后斷頭取腦；腦水腫LDHAb組在制成模型后腹腔注射LDHAb(10mL/kg)，30min后斷頭取腦。通過水分分析儀分別測定各組腦灰、白質(zhì)水分含量百分比。用EB測定血腦屏障的通透性。用圖像分析儀分析LDH染色圖片，測定LDH

14、活性。 研究結(jié)果 1大鼠血管源性腦水腫模型的制作 ①腦水腫組腦組織灰、白質(zhì)水分含量與正常組腦組織相比有統(tǒng)計學(xué)差異(灰質(zhì)：t=9.929，P＜0.01；白質(zhì)：t=12.515，P＜0.01)。②兩組之間腦組織灰質(zhì)水分含量差值與腦組織白質(zhì)水分含量差值相比有統(tǒng)計學(xué)差異(t=4.649，P＜0.01)。③腦水腫組與正常組織EB滲出量有統(tǒng)計學(xué)差異(t=12.387，P＜0.01)。 2乳酸脫氫酶抗體對大鼠血管源性腦

15、水腫的保護(hù) ①腦水腫甘露醇組和腦水腫LDHAb組腦灰、白質(zhì)的水分含量百分比顯著低于腦水腫組[灰質(zhì)：(72.69±1.90)％，(72.78±1.34)％，(76.53±1。39)％，P＜0.01；白質(zhì)：(73.63±1.11)％，(69.58±2.73)％，(77.45±2.38)％，P＜0.01]。腦水腫甘露醇組與腦水腫LDHAb組相比腦灰質(zhì)水分百分比差異無顯著性意義(P＞0.05)，白質(zhì)水分含量差異有顯著性意義(P＜0.01

16、)。②腦水腫甘露醇組和腦水腫LDHAb組EB滲出量與腦水腫組相比有顯著性下降[(0.0626±0.0033)，(0.0441±0.0056)，(0.0736±0.0032)OD/g(P＜0.01)]。與腦水腫甘露醇組相比，腦水腫LDHAb組EB滲出量有顯著下降(P＜0.01)。③與腦水腫甘露醇組相比，腦水腫LDHAb組LDH活性有顯著下降[(0.6677士0.0883)，(0.4427士0.0439)OD/g(P＜0.05)]。

17、 結(jié)論 1.用注射苯腎上腺素方法制成的VBE模型是一種較理想的、與人類發(fā)病條件相似的VBE模型。 2.LDH活性的變化與VBE有密切關(guān)系，VBE發(fā)生時LDH的活性明顯升高，故推測LDH的活性變化對VBE的發(fā)生發(fā)展有重要作用； 3.LDHAb可特異地抑制LDH活性； 4.LDHAb對減少VBE大鼠腦灰、白質(zhì)水分含量、降低BBB通透性均有顯著效果； 5.與甘露醇相比，LDHAb減輕腦白質(zhì)水分含量，降低