乙醛脫氫酶2（ALDH2）對(duì)大鼠心肌缺氧損傷的保護(hù)作用.pdf

1、缺血缺氧引起心肌線粒體的功能和代謝改變，在心肌缺血缺氧的發(fā)病機(jī)理中處于非常重要的地位，心肌線粒體損傷誘導(dǎo)的凋亡蛋白表達(dá)的過(guò)程是多因素、多環(huán)節(jié)參與的病理過(guò)程，對(duì)它致病機(jī)理的研究已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是“后基因組時(shí)代”蓬勃發(fā)展的技術(shù)體系新型學(xué)科群，其特點(diǎn)是采用高通量、高分辨率的蛋白鑒定技術(shù)，全景式研究在特定病理?xiàng)l件下的蛋白表達(dá)譜，由此在蛋白質(zhì)水平上對(duì)疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過(guò)程有更全面的認(rèn)識(shí)，可獲得一些傳統(tǒng)手段無(wú)法得到的新蛋白標(biāo)志物和新關(guān)

2、鍵分子，極大地豐富診斷標(biāo)志物的選擇及對(duì)復(fù)雜致病機(jī)理的全面闡明。本研究針對(duì)大鼠心肌缺血缺氧模型的心肌線粒體，進(jìn)行全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜差異分析，篩出一些有潛在應(yīng)用價(jià)值的差異蛋白，并在心肌組織和心肌細(xì)胞對(duì)其中的差異分子，用特異的抑制劑和基因轉(zhuǎn)染等細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行功能的分析和驗(yàn)證。 第一部分大鼠心肌缺血缺氧模型的線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)蛋白質(zhì)分析 目的：利用差異蛋白質(zhì)譜識(shí)別缺血缺氧大鼠心肌線粒體代謝異常的蛋白。材料和

3、方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分心梗組和對(duì)照組(每組9只)。對(duì)大鼠行左冠脈前降支結(jié)扎，術(shù)后4周，以LVEF達(dá)46．4±10．9％左右作為成功建立大鼠心梗模型，將之處死后，分別取左心室：先制作電鏡標(biāo)本，觀察形態(tài)改變：然后進(jìn)行心肌線粒體抽提，利用雙向凝膠電泳技術(shù)顯示差異蛋白的表達(dá)譜，再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析。發(fā)現(xiàn)蛋白的表達(dá)差異后，分別在心梗3d、7d、14d和28d后，用RT-PCR和westernblot方法證實(shí)心肌該蛋白的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)隨時(shí)

4、間變化的差別。另一方面，在用酶消化法獲得心肌細(xì)胞后，制作細(xì)胞的缺氧模型，測(cè)定離體心肌細(xì)胞線粒體該蛋白酶在不同缺氧時(shí)間內(nèi)的活性變化。結(jié)果：大鼠心梗的心肌線粒體電鏡下出現(xiàn)線粒體腫脹，基質(zhì)變淡，嵴膜疏短破壞等病理變化。在雙向凝膠電泳技術(shù)顯示差異蛋白的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中有3個(gè)點(diǎn)表達(dá)有顯著差異，經(jīng)膠內(nèi)酶解后，行質(zhì)譜鑒定和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析，其中一條蛋白被證實(shí)為乙醛脫氫酶2(Aldehvdedehydrogenase2ALDH2)，它在大鼠缺血缺氧心肌中

5、的表達(dá)顯著下降，并隨心梗時(shí)間延長(zhǎng)，心肌ALDH2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)。在細(xì)胞水平的心肌線粒體(純度達(dá)90％以上)，用乙醛代謝法測(cè)得ALDH2的酶活性也隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。結(jié)論：在缺血缺氧大鼠的心肌線粒體中乙醛脫氫酶2表達(dá)顯著下調(diào)，心肌缺血缺氧與ALDH2的表達(dá)和活性下降相關(guān)。 目的：檢測(cè)乙醛脫氫酶2(ALDH2)被daidzin抑制時(shí)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，驗(yàn)證乙醛脫氫

6、酶2(ALDH2)在此過(guò)程中所起的作用。材料和方法：在確定daidzin的最佳抑制濃度后，運(yùn)用心肌細(xì)胞缺氧模型，比較大鼠心肌細(xì)胞在單獨(dú)缺氧和經(jīng)ALDH2特異性抑制劑daidzin預(yù)處理24h后缺氧的凋亡和MAPK信號(hào)通路的改變。酶活性檢測(cè)采用乙醛代謝法、ROS的檢測(cè)用C400測(cè)定，凋亡的測(cè)定通過(guò)用Hoechest33324、免疫熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞儀和TUNEL試劑盒檢測(cè)，MAPK信號(hào)通路酶(ERKl／2、JNK、P38)磷酸化的改變用w

7、esternblotting的方法檢測(cè)。結(jié)果：60uMdaidzin濃度是ALDH2酶活性被抑制而細(xì)胞無(wú)凋亡發(fā)生的最佳工作濃度。在daidzin(60uM)預(yù)處理24h后再經(jīng)缺氧誘導(dǎo)，比單獨(dú)缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡更為明顯：表現(xiàn)為在Hoechest33324染色中，細(xì)胞核溶解和核碎裂(P<0．05)，在FACS和TUNEL的檢測(cè)中，凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0．05)，經(jīng)凋亡后的死亡細(xì)胞有增加趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)與MAPK信號(hào)通路有關(guān)的磷

8、酸化ERKl／2、JNK和P38的酶活性均表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：daidzin使ALDH2酶活性降低可增加心肌細(xì)胞對(duì)缺氧導(dǎo)致凋亡的易感性，其機(jī)理是與細(xì)胞ROS和凋亡的增加及MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。ALDH2對(duì)缺氧引起的細(xì)胞凋亡損傷具有保護(hù)作用。 目的：通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2(ALDH2*1／ALDH2*2)基因，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，進(jìn)一步證明乙醛脫氫酶2(ALDH2)在此過(guò)程

9、中所起的作用。材料和方法：運(yùn)用細(xì)胞缺氧模型(同上)，比較大鼠心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2(ALDH2*1／ALDH2*2)基因再缺氧后ROS、4一HNE、凋亡、MAPK酶活性、bcl2和P53的改變，酶活性檢測(cè)采用乙醛代謝法、ROS的檢測(cè)用C400測(cè)定，凋亡的測(cè)定通過(guò)用Hoechest33324、免疫熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞儀和TUNEL試劑盒檢測(cè)，4一HNE的檢測(cè)用免疫組織化學(xué)法，MAPK信號(hào)通路酶(ERKl／2、INK)磷酸化的

10、改變用westernblotting的方法檢測(cè)，而bcl2和P53分別用RT-PCR和westernblotting的方法檢測(cè)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染ALDH2野生型(ALHD2*I)和缺失型(ALDH2*2)基因后再缺氧，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染缺失型(ALDH2*2)的心肌細(xì)胞對(duì)缺氧性損傷的耐受性明顯差于野生型(ALHD2,1)的(P<0．05)。與運(yùn)用ALDH2特異性抑制劑daidzin不同的是：轉(zhuǎn)染ALHD2*i和ALDH2*2后再缺氧，都對(duì)ROS的產(chǎn)生

11、和MAPK途徑(ERKl／2和JNK的磷酸化)沒(méi)有影響(P>0．05)；而在轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2*2基因再缺氧組，除了有細(xì)胞凋亡的增加外(P<0．05)：表現(xiàn)在Hoechest33324染色(核溶解和核碎裂)，F(xiàn)ACS和TUNEL檢測(cè)，還有4一HNE的明顯增加(P<0．05)。從bcl2和P53的RT一PCR和westernblot結(jié)果分析，轉(zhuǎn)染野生型(ALHD2*i)的缺氧心肌細(xì)胞bcl2表達(dá)增高，P53表達(dá)下降，與缺失型(ALDH2

12、*2)的結(jié)果相反。結(jié)論：4一HNE可能是細(xì)胞氧化損傷的重要作用因素。ALDH2*i可降解氧化物質(zhì)4一HNE，它的抗凋亡作用不以ROS—MAPK途徑為主，有可能與bcl2一P53的ROS非依賴性刺激的凋亡途徑有關(guān)，ALDH2酶活性降低可增加心肌細(xì)胞對(duì)缺氧導(dǎo)致凋亡的易感性，ALDH2對(duì)缺氧引起的細(xì)胞凋亡損傷具有保護(hù)作用。 結(jié)論 1．缺血缺氧性損傷可能與大鼠心肌線粒體中乙醛脫氫酶2(ALDH2)的表達(dá)和活性顯著下降有關(guān)。

13、 2．daidzin使ALDH2酶活性降低后，心肌細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性下降，并對(duì)缺氧導(dǎo)致凋亡的易感性增加，此時(shí)細(xì)胞ROS和凋亡的增加與MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。 3．轉(zhuǎn)染ALHD2*i和ALDH2*2對(duì)缺氧損傷的心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和MAPK(ERKl／2和JNK)途徑?jīng)]有影響。ALDH2*i可降解氧化物質(zhì)4一HNE，它的抗凋亡作用不以ROS—MAPK途徑為主，可能與bcl2一P53的ROS非依賴性刺激的抗凋亡途徑有關(guān)。