嗜鹽古菌Archaeal類泛素蛋白SAMP1的激活及底物綴合功能研究.pdf

1、真核生物和古菌中泛素(UB，Ubiquitin)和類泛素(UBL，Ubiquitin-like protein)在與底物蛋白的綴合途徑和細(xì)胞代謝活動中扮演著重要的角色，其作用包括參與蛋白酶水解，泛素化(ubiquitylation)中的硫轉(zhuǎn)移代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及染色質(zhì)的重塑和蛋白運輸?shù)?。而菌體本身為適應(yīng)高鹽濃度的生長環(huán)境，進化出適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外高滲透壓平衡的生理機制，進而研究人員對其泛素-蛋白酶體通路是怎樣在高鹽濃度的環(huán)境中保持正常生理

2、活性產(chǎn)生了濃厚的研究興趣，從而可為真核生物（植物）在抗鹽抗旱研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。本研究以嗜鹽古菌（Haloferax volcanii）為研究對象，根據(jù)嗜鹽古菌類泛素蛋白SAMPs(small archaea modifier protein)所具有的β-grasp3D折疊結(jié)構(gòu)、C端雙甘氨肽(GlyGly)和進化過程的類泛素生化功能，應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)，研究了嗜鹽古菌Archaeal類泛素蛋白SAMP1的激活、硫代羧化和底物綴

3、合反應(yīng)的功能，取得了以下研究結(jié)果:
　　1.嗜鹽古菌（Haloferax volcanii）類泛素蛋白SAMP1的綴合底物蛋白類型和綴合位點。
　　應(yīng)用基因克隆方法對古菌類泛素samp1基因進行重組，構(gòu)建帶有N端蛋白標(biāo)簽的SAMP1/SAMP1 S85K/R表達質(zhì)粒與整合質(zhì)粒，在二甲基亞砜誘導(dǎo)作用下完成細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒/基因組的泛素化表達與富集。利用親和色譜對SAMP1/SAMP1突變體蛋白分離純化，得到SAMP1-綴合底物聚合體

4、，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Westernblot)確定蛋白組分，經(jīng)胰蛋白酶酶切聚合體肽段賴氨酸殘基上的GlyGly標(biāo)簽，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法對酶切產(chǎn)物及其修飾位點進行分析。
　　(1)鑒定出與SAMP1綴合的底物蛋白有鉬喋呤合成酶（MoaE，Molybdenumcofactor biosynthesis protein）、SAMPs激活酶(UbaA,Molybd

5、opterin biosynthesisprotein)、蛋氨酸亞砜還原酶A/B(MsrA/MsrB，methionine sulfoxide reductasehomologs)、SAMP3和Fe-S簇組裝蛋白SufB(FeS assembly protein)6種，且底物蛋白被SAMP1雜鏈多重修飾。
　　(2)基因組表達的SAMP1在無氧呼吸作用中起到硫載體和UBL修飾蛋白的作用，并且其綴合作用被DMSO激活。SAMP1化可

6、以調(diào)控嗜鹽古菌從有氧呼吸過渡至無氧呼吸，這是嗜鹽古菌能夠在鹽湖生存的重要原因之一。
　　2.嗜鹽古菌（Haloferax volcanii）的類泛素活化酶UbaA在細(xì)胞內(nèi)的催化特性。
　　應(yīng)用基因組學(xué)方法對類泛素活化酶UbaA進行基因重組和定點突變，構(gòu)建UbaAK87R，D131N和C188A突變菌株，通過添加蛋白標(biāo)簽純化得到UbaA二聚體。利用LC-MS/MS和Phyre2工具（蛋白同源體/AnalogY識別引擎）構(gòu)建類泛

7、素活化酶UbaA的3D模型，分析與三磷酸腺苷(ATP)（包括腺苷酸-嘌呤核苷磷酸化酶，AMP-PNP）的結(jié)合位點。
　　(1)當(dāng)UbaA與SAMPs在1∶2的摩爾比條件下，核苷酸能夠刺激UbaA與SAMPs的非共價修飾（UbaA二聚體和SAMP單體），此修飾通過結(jié)合敏感性N-乙基馬來酰亞胺(NEM)殘基，使UbaA與SAMPs在ATP水解作用下形成單一的硫醇鍵，從而活化SAMPs蛋白，對SAMPs C端雙甘氨殘基發(fā)生的SAMP化起

8、到關(guān)鍵的作用。
　　(2)通過UbaA的3D模型分析，得到UbaAP-loop相關(guān)基序的位置、保守的半胱氨酸殘基(Cys188)以及ATP和Zn2+的協(xié)同結(jié)合位點，得出UbaA的D131具有協(xié)調(diào)Mg2+與ATP的α(β)磷酸鹽的功能。
　　(3)利用親和色譜法和SDS-PAGE方法對SAMPs與UbaA進行胞內(nèi)綴合分析，得出SAMP1與UbaA具有與激活酶UbaA殘基和與UbaA的ATP結(jié)合囊附近的保守殘基結(jié)合2種功能。同時

9、發(fā)現(xiàn)與UBL活化酶UbaA相關(guān)的綴合蛋白為類硫氰酸酶-UbaC和MPT合成酶的催化亞單位MoaE。
　　(4)通過差示掃描熒光法分析UbaA的核苷酸配基和UbaA-StrepⅡ熔解曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以核苷酸作為配基的條件下，當(dāng)ATP和非水解AMP-PNP與UbaA反應(yīng)時，所有反應(yīng)的TM值明顯升高，ADP對TM值的升高有一定的影響，而AMP，CTP，GTP，UTP和TTP對TM值沒有效應(yīng)。
　　3.對嗜鹽古菌（Haloferax

10、 volcanii）類泛素蛋白SAMP1和激活酶E1-like UbaA的分子功能的探究，發(fā)現(xiàn)SAMP1具有轉(zhuǎn)譯后蛋白綴合(posttranslational protein-conjugation)與硫轉(zhuǎn)移（sulfur mobilization）2種細(xì)胞功能，其中包括SAMP1的多種修飾底物蛋白和蛋白綴合位點;從SAMP1與UbaA蛋白的結(jié)構(gòu)因素和酶組分，驗證了SAMP1的活化機制和下游調(diào)控的硫轉(zhuǎn)移通路和蛋白綴合機制。這一研究對SA