古菌Sulfolobus tokodaii中絲-蘇氨酸蛋白激酶與FHA底物的互作研究.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激最通常的反應(yīng)機(jī)制，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。然而，在古菌中，我們對(duì)磷酸化反應(yīng)涉及的蛋白激酶以及相應(yīng)的磷酸化底物知之甚少。在本論文研究中，我們從古菌Sulfolobustokodaiistr.7中第一次鑒定出一個(gè)典型的真核型絲/蘇氨酸蛋白激酶(STPK)ST1565以及它的作用底物--FHA結(jié)構(gòu)域包含蛋白ST0829，并對(duì)磷酸化反應(yīng)的條件以及二者保守結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了分析，主要取得了以下幾

2、個(gè)方面的結(jié)果：
　　 (1)通過(guò)細(xì)菌雙雜交和Pull-down/western等試驗(yàn)證實(shí)了ST1565與ST0829能發(fā)生物理的相互作用。(2)蛋白激酶ST1565的自磷酸化與底物磷酸化過(guò)程均以Mn2+為最佳輔助因子，最適反應(yīng)溫度為45℃，最佳反應(yīng)pH范圍為5.5-7.5。(3)通過(guò)一系列定點(diǎn)突變對(duì)蛋白激酶功能結(jié)構(gòu)域和FHA結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了分析和鑒別，發(fā)現(xiàn)多數(shù)保守氨基酸殘基的突變使磷酸化反應(yīng)的活性下降，其中T-329是激酶

3、的主要活性位點(diǎn)，而T-326則是負(fù)調(diào)控位點(diǎn)。(4)ST0829的保守FHA結(jié)構(gòu)域上一些氨基酸的替代突變使其喪失了與ST1565的物理相互作用，并且在進(jìn)一步的ST0829的FHA結(jié)構(gòu)域的空間模型構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)均位于蛋白質(zhì)的邊緣，可能組成潛在的互作結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶ST1565發(fā)生相互作用。
　　 本研究首次在第三域生命--古菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)典型的類真核STPK能夠相互作用并磷酸化它的FHA蛋白底物，這些結(jié)果不僅提高了我們對(duì)古菌