人胚發(fā)育過(guò)程中大腦皮層Bcl-2、PCNA表達(dá)時(shí)相的變化.pdf

1、目的：Bcl-2家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡中起重要的作用。Bcl-2家族成員之間可形成同源二聚體或異源二聚體，這種二聚體反應(yīng)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和存活信號(hào)的平衡狀態(tài)，是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中起抗凋亡作用最關(guān)鍵的成員，其表達(dá)在決定神經(jīng)元的存活方面發(fā)揮重要的作用。 Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)的

2、合成和出現(xiàn)受細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，與細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)。PCNA分子結(jié)構(gòu)的特性為它與DNA及與其相互作用的蛋白質(zhì)的結(jié)合奠定了基礎(chǔ)。已知很多蛋白質(zhì)通過(guò)與PCNA的結(jié)合來(lái)增加其催化活性，也因此PCNA參與了神經(jīng)細(xì)胞的DNA合成、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、染色體重組、DNA甲基化、以及細(xì)胞凋亡等多種過(guò)程，最終影響了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟。 神經(jīng)元的發(fā)育和再生是神經(jīng)科學(xué)中令人關(guān)注的研究領(lǐng)域，其如何發(fā)育是神經(jīng)科學(xué)中最熱門的問(wèn)題，也是非常必要的。本

3、研究通過(guò)對(duì)人胚神經(jīng)元Bcl-2、PCNA表達(dá)時(shí)相變化的研究，用形態(tài)學(xué)的方法揭示神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的機(jī)理，進(jìn)而探討神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)因素，揭示神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)理的相關(guān)關(guān)系，為降低神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病率提供理論基礎(chǔ)。 方法：本研究擬采用收集的3、4、5、6、7月不同胎齡的人胚大腦組織標(biāo)本，分別從胎兒大腦組織皮層，以中央前回為界取第一運(yùn)動(dòng)區(qū)，利用HE染色、電鏡超薄切片技術(shù)、Bcl-2和PCNA免疫組織化學(xué)等方法，觀察人胚胎不同月齡

4、大腦組織神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)及Bcl-2、PCNA表達(dá)的時(shí)相變化。采用胎兒標(biāo)本共24例，這些胎兒均無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)的病變和畸形。普通HE染色和透射電鏡觀察采用常規(guī)方法進(jìn)行。免疫組化染色先用10％福爾馬林固定48h，再以54℃石蠟包埋，切成6 μm切片，用北京中杉生物技術(shù)有限公司的Bcl-2、PCNA蛋白抗體作ABC染色，DAB顯色6-8 min。結(jié)果：光鏡觀察發(fā)現(xiàn)從胚胎3月齡可區(qū)分皮質(zhì)和髓質(zhì)，大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大而圓，突起少；從4月齡

5、開(kāi)始，大腦皮質(zhì)逐漸分為分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層五層。神經(jīng)元的突起增多，長(zhǎng)度逐漸加長(zhǎng)。隨著月齡的增加，外顆粒層相對(duì)厚度下降，絕對(duì)厚度增加；7月齡時(shí)，分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層分層明顯，突起數(shù)量更多，長(zhǎng)度更長(zhǎng)。電鏡觀察：3月齡時(shí)，大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大，胞質(zhì)少，突起亦少，胞質(zhì)內(nèi)充滿尚未發(fā)育成熟的核糖體和高爾基復(fù)合體，線粒體少而幼稚，此時(shí)突觸處于形成期，突觸前膜、突觸后膜

6、和突觸間隙已清晰可辨，突觸小泡較少：5月齡時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞增大，胞質(zhì)中細(xì)胞器的種類和數(shù)目較3月齡時(shí)明顯增多，胞質(zhì)中含有較豐富的線粒體，高爾基復(fù)合體位于核周質(zhì)中部，呈環(huán)形排列，可伸至一級(jí)樹突。絕大多數(shù)突觸依然是突觸樣連接，特點(diǎn)是兩膜呈對(duì)稱性增厚，突觸間隙清晰可見(jiàn)，突觸前終末內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)較幼稚，突觸小泡較少；7月齡時(shí)，神經(jīng)元基本成熟，胞質(zhì)中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核糖體，高爾基復(fù)合體趨于成熟，可見(jiàn)大量分泌泡。細(xì)胞突起的數(shù)量增多且較長(zhǎng)。突觸結(jié)

7、構(gòu)也趨于成熟，突觸前、后膜增厚，突觸前終末內(nèi)的小泡增多，且向前膜聚集，突觸樣連接數(shù)目減少，典型突觸增多。免疫組織化學(xué)：1.Bcl-2表達(dá)各月齡組Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物均定于神經(jīng)元的胞質(zhì)，胞核不表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞分布在各層。Bcl-2在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中隨月齡的增長(zhǎng)，大腦皮層第一運(yùn)動(dòng)區(qū)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化如下：在3月齡時(shí)，胞質(zhì)中未見(jiàn)陽(yáng)性顆粒表達(dá)；在4月齡時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)少量的陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞突起少。陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于胞質(zhì)；5、6、7月齡時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，突

8、起逐漸加長(zhǎng)，胞體和突起均為陽(yáng)性，Bcl-2蛋白表達(dá)密度逐漸增強(qiáng)。2.PCNA表達(dá)各月齡組PCNA免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物均定于神經(jīng)元的胞核，胞質(zhì)不表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞分布在各層，3個(gè)月時(shí)主要表達(dá)在室管膜層，4月份以后陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，隨著月齡的增加細(xì)胞體積增大、排列松散，陽(yáng)性細(xì)胞隨著月齡增加逐漸向其他各層遷移，陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。結(jié)論： 1在人胚胎大腦發(fā)育的過(guò)程中，隨著月齡的增加，大腦皮層Bcl-2的含量逐漸升高，具體表現(xiàn)為：在3月齡時(shí)，