小鼠大腦皮層發(fā)育相關基因自然反義轉錄物的篩選與鑒定.pdf

1、非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)已成為當今生命科學領域研究熱點之一，隨著ncRNA重要功能不斷被發(fā)現(xiàn)，越來越引起科學界對這些ncRNA的重視。非編碼RNA對基因的表達調(diào)控起著至關重要的作用，對生物生長發(fā)育、疾病發(fā)生等生理過程具有廣泛影響。
　　 長非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是指一類長度大于200nt，但并不具備編碼蛋白質功能的基因轉錄產(chǎn)物。長非編碼RNA在生物體生長發(fā)育

2、的各個階段發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，如在胚胎發(fā)育階段，它可以引起可遺傳的等位基因后期沉默，表觀性狀維持，對多細胞動物的正常發(fā)育和細胞分化至關重要。作為一類新類型的長非編碼RNA，天然反義轉錄物(Naturalantisensetranscripts，NAT)由蛋白編碼基因的反義鏈轉錄產(chǎn)生，其中少數(shù)NAT可以編碼蛋白。它是在自然環(huán)境中生物體內(nèi)存在的反義RNA分子，與對應的正義RNA(senseRNA)通過堿基互補配對，發(fā)揮其對正義基因的調(diào)控作

3、用。
　　 1976年，Barrell等在病毒中發(fā)現(xiàn)NAT的存在，之后相繼在人類、小鼠、大鼠、雞、果蠅、線蟲和水稻、擬南芥、酵母等各種動植物中得到證實。在不同物種中間NAT廣泛存在，如大約15％的人蛋白編碼基因存在NAT。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物中，NAT通過參與包括基因組印記、RNA干擾、轉錄、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪接、X染色體失活和RNA編輯等多種基因表達調(diào)控過程，影響了生物體的發(fā)育以及疾病的發(fā)生。而我們對NAT在神經(jīng)

4、系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮的作用還知之甚少，本研究旨在尋找與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關的NAT，通過大規(guī)模的篩選與鑒定，尋找小鼠大腦新皮層發(fā)育過程中相關的基因的NAT，并對其功能做初步探索。
　　 我們選取了小鼠大腦皮層發(fā)育相關的63個基因作為候選基因，這些基因包括了在皮層形成過程中起到重要作用的轉錄因子，皮層特異層次的標記分子等。它們對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育特別是皮層發(fā)育都起到了至關重要的作用。通過北京大學NAT預測網(wǎng)站http://natsdb.cb

5、i.pku.edu.cn/，對候選基因進行NAT預測，預測結果顯示有31個基因可能存在反義轉錄物。我們用成年鼠腦，E12.5天胎腦，小鼠胚胎成纖維細胞、NIH小鼠成纖維細胞作為篩選材料，用鏈特異性RT-PCR的方法鑒定，結果確定了8個基因存在NAT。為了對NAT功能進行深入探索，我們應用cDNA末端快速擴增的方法，對8個NAT3’5’末端進行擴增，得到特異的產(chǎn)物后連接到pGEM-T載體中測序，結果得到Id2-NAT,Mef2c-NAT,

6、Foxgl-NAT3’端的序列信息，Lmo4-NAT,Ldb2-NAT,Foxg1-NAT5’端的序列信息。
　　 NAT所發(fā)揮的生物學功能與其時空定位密切相關，為了更好的開展NAT與其基因相互作用關系的研究，進而了解它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，我們首先用原位雜交的方法觀察了Lmo4，Ldb2，F(xiàn)oxg1及其相應的反義轉錄物在小鼠大腦皮層中的表達情況，根據(jù)得到的NAT的序列信息設計反義轉錄物的原位雜交探針，發(fā)現(xiàn)了Foxg1及其NA