TAZ通過影響放射狀膠質(zhì)細胞的增殖周期來調(diào)節(jié)大腦皮層發(fā)育.pdf

1、目的：哺乳動物的大腦皮層是由I-VI層特異性錐體神經(jīng)元組成的多層結(jié)構(gòu)，這些神經(jīng)元是由腦室區(qū)域的放射狀膠質(zhì)細胞（Radial glial cells，RGCs）經(jīng)過不對稱分裂產(chǎn)生的，并且它們的產(chǎn)生以及遷移有一個明確的時間順序和空間排布。大腦皮層神經(jīng)元的生成是一個由內(nèi)而外的生成模式：早期生成的神經(jīng)元經(jīng)過遷移位于皮層深層，而晚期生成的神經(jīng)元定位在皮層淺層。但目前調(diào)控皮層神經(jīng)元產(chǎn)生的分子機制尚不是很清楚。Transcriptional coac

2、tivator with PDZ-binding motif（TAZ），是一個基于PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其通過調(diào)控干細胞的增殖、分化與凋亡參與干細胞的分化和多器官的形成。本論文主要探索 TAZ在大腦皮層發(fā)育中的調(diào)控作用。
　　方法：⑴收集C57/BL6小鼠胚胎各時期（E12、E14、E16、E18）及P0（出生當天）的腦組織冰凍切片，利用免疫熒光染色及Western blot技術(shù)檢測TAZ在皮層的表達位置及表達水平的情況

3、。⑵TAZ-/-胎鼠腦體積與同窩TAZ+/+胎鼠腦體積的對比，檢測敲除TAZ對大腦體積的影響。⑶通過免疫熒光染色的方法，用放射狀膠質(zhì)細胞（RGCs）marker（Pax6）檢測放射狀膠質(zhì)細胞的變化情況，用中間前體細胞（IPCs）marker（Tbr2）來檢測中間前體細胞的變化情況。⑷5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine; BrdU）可以標記正在進行DNA復制的細胞，用它的相應(yīng)抗體BrdU通過免疫熒

4、光的方法檢測神經(jīng)干細胞的增殖情況，用處在細胞周期中的細胞的標志蛋白Ki67以及有絲分裂期的標志蛋白PH3（Phospho-histone H3）通過免疫熒光染色再次檢測神經(jīng)干細胞的增殖情況。⑸用Pax6/Tbr2分別和BrdU雙標，檢測放射狀膠質(zhì)細胞和中間前體細胞的增殖情況。⑹用BrdU和Ki67雙標的免疫熒光技術(shù)檢測細胞周期出口以及S期的長度。⑺用皮層各層神經(jīng)元的特異性蛋白Tbr1（標記第VI神經(jīng)元）、Ctip2（標記第V層神經(jīng)元）以

5、及Cux1（標記II-IV層神經(jīng)元）通過免疫熒光技術(shù)檢測各層神經(jīng)元的變化情況。用星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP、BLBP通過免疫熒光技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞的變化。
　　結(jié)果：①TAZ在E12至P0各個時期均在小鼠腦組織中有表達，且表達水平隨胚胎年齡增高呈逐漸上升趨勢。②TAZ基因敲除導致小鼠大腦體積減小。③TAZ基因敲除導致RGCs細胞數(shù)目增加。④TAZ基因敲除引起RGCs細胞周期S期增長、細胞周期出口的降低，從而促進RGCs的增殖。