蛋白酶體抑制劑MG115對轉基因枸杞懸浮細胞表達重組HIV-1殼體蛋白含量影響的初步研究.pdf

1、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（HIV－1）是引起艾滋病全球性流行的主要病原體，HIV感染已成為威脅人類健康及社會發(fā)展的主要問題之一。P24殼體蛋白（capsid，CA）是HIV-1早期感染的一個重要標志， CA的N-末端與少至4個基質蛋白（Matric，MA）的氨基酸殘基結合可以形成球狀顆粒結構，這種球狀結構有利于病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs）結構和功能的形成。動物及Ⅰ期臨床實驗均已證實，HIV CA VLPs

2、疫苗能夠引起機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應答。 植物表達系統(tǒng)屬于真核細胞表達系統(tǒng)，利用植物生產(chǎn)重組蛋白具有很多優(yōu)點，包括：降低攜帶動物性病原體的危險性、易于純化、不需特殊的運輸和儲藏條件、植物培養(yǎng)基價格低廉降低生產(chǎn)成本、能進行正確的轉譯后修飾加工使產(chǎn)生的外源蛋白具有生物學活性及形成多聚體等，因此被認為是一個比微生物或動物更理想的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。目前為止，已在轉基因植物中成功表達了抗體、抗原疫苗、酶、酶抑制劑、細胞因子、凝血因子和激素等物

3、質。 轉基因植物作為生物反應器表達重組蛋白安全、經(jīng)濟和有效，但是重組蛋白在植物中表達量非常低，僅占可溶性總蛋白的0．01％～0．4％。盡管從基因轉錄和翻譯水平等環(huán)節(jié)進行了條件優(yōu)化，但是蛋白降解依舊是影響植物系統(tǒng)表達外源重組蛋白含量的重要因素。近年來利用植物懸浮細胞生產(chǎn)重組蛋白引起了人們的關注，植物細胞懸浮培養(yǎng)無需支持物，可以大規(guī)模培養(yǎng)，而且培養(yǎng)條件可以人工調(diào)控，從而為生產(chǎn)高產(chǎn)量的重組蛋白奠定基礎。真核細胞內(nèi)大部分蛋白質的降解是通

4、過泛素－蛋白酶體途徑，研究表明抑制蛋白酶體的活性可以提高細胞中蛋白的含量。在細胞內(nèi)轉入含有糜蛋白酶和胰蛋白酶樣抑制位點的絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅱ基因使轉基因水稻懸浮細胞的蛋白酶活性降低23％，重組蛋白人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子的含量提高了2倍；將廣譜抑制劑組織蛋白酶D基因導入馬鈴薯，外源基因表達產(chǎn)物TSP的產(chǎn)量提高20％-35％。 本課題組已將源于水稻的一個富含甘氨酸序列的信號肽（GRP）連接在MA4-CA融合基因的3’端，并將

5、該融合基因轉入到枸杞中，成功地建立了表達MA4-CA重組蛋白的轉基因植株及根分泌表達系統(tǒng)。在此基礎上，本研究旨在利用轉基因枸杞愈傷組織建立懸浮細胞表達重組蛋白系統(tǒng)，并通過一系列濃度的特異性蛋白酶體抑制劑MG115作用于轉基因枸杞懸浮細胞，探討有效提高外源重組蛋白HIV-1 CA的可行性。 研究目的： 利用本實驗室構建的分泌型植物表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌對枸杞進行遺傳轉化，建立轉基因枸杞的再生植株表達系統(tǒng)和懸浮細胞表達系統(tǒng)

6、。在分析發(fā)現(xiàn)轉基因枸杞蛋白酶體活性增強的基礎上，通過蛋白酶體抑制劑MG115對懸浮細胞蛋白酶體活性的作用探討抑制劑對轉基因枸杞懸浮細胞重組HIV-1殼體蛋白含量的影響，為進一步研究植物HIV-1 CA VLPs疫苗及今后大量生產(chǎn)高純度的重組蛋白奠定基礎。 研究方法： （1）轉基因枸杞再生植株及懸浮細胞系的建立：應用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，利用不同激素配比進行枸杞愈傷誘導，分化誘導，利用愈傷組織篩選穩(wěn)定的表達重組蛋白CA的

7、懸浮細胞系統(tǒng)。 （2）表達重組HIV殼體蛋白轉基因枸杞懸浮細胞的鑒定：提取枸杞懸浮細胞基因組DNA，PCR擴增分析轉基因植株內(nèi)的目的基因；ELISA、Western blot及免疫組織化學方法鑒定轉基因枸杞中HIV CA的表達。 （3）轉基因枸杞懸浮細胞表達HIV CA含量的研究：選取生長良好的枸杞懸浮細胞，分別加入一系列濃度的抑制劑MG115共培養(yǎng)，熒光底物法檢測懸浮細胞蛋白酶體活性的變化，ELISA、Western

8、blot及免疫組織化學方法觀察細胞內(nèi)HIV殼體蛋白含量的變化。 研究結果： （1）應用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，利用6－BA、NAA、2，4－D和KT成功地進行了枸杞的愈傷、再生芽及根系誘導，并利用愈傷組織建立了轉基因枸杞的懸浮細胞表達重組蛋白CA系統(tǒng)。 （2）PCR結果顯示MA4－CA融合基因成功導入枸杞中；Western blot證實轉基因枸杞中的MA4－CA融合蛋白以約55kDa存在：經(jīng)N－糖苷酶處理后，We

9、stern blot在37kDa和26kDa檢測到各有一條帶，說明轉基因枸杞懸浮細胞表達的CA為其糖基化形式。 （3）適宜濃度的MG115可以顯著性抑制蛋白酶體活性，ELISA、Western blot及免疫組織化學方法檢測到50μM和100μM的MG115能有效提高轉基因枸杞懸浮細胞中HIV殼體蛋白的含量。 結論： 利用根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化枸杞，成功地對轉基因植株進行了分化誘導，并利用獲得抗性愈傷組織建立

10、了穩(wěn)定表達HIV CA的轉基因枸杞懸浮細胞系統(tǒng)。PCR結果表明MA4-CA融合基因已經(jīng)導入枸杞基因組中：Western blot表明CA以分子量55KDa左右存在于枸杞中，糖苷酶處理蛋白證實枸杞懸浮細胞表達的CA以糖基化形式存在；免疫組織化學實驗表明MA4-CA主要分布于細胞壁和細胞膜。熒光底物法測定枸杞蛋白酶體活性發(fā)現(xiàn)轉基因枸杞細胞蛋白酶體的活性為正常枸杞的4．2倍。ELISA、Western blot和immunohistolche