不同強度和時程應激對不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達及習慣化表達的研究.pdf

1、熱休克反應是機體在高溫、缺血、缺氧、感染、休克等各種不利因素作用下發(fā)生的細胞程序化反應，可以起到保護休克結局的作用。熱休克蛋白家族(HSPs)是此過程中明顯表達的一組序列高度保守的伴隨細胞蛋白，參與細胞的應激保護機制，增強機體的抗感染、耐高溫、抗休克能力。應激引起多種組織器官的HSP家族表達水平增加，其中HSP70是最重要、表達范圍最廣泛、表達量最多的一組。 在正常組織細胞中，HSP70可存在于細胞漿、內質網(wǎng)腔及線粒體等部位，應

2、激時，HSP70進入細胞核并包圍核仁，恢復后進入胞漿[2]。HSP70具有多種生物學功能：參與免疫調節(jié)，抑制高溫應激時活性氧(ROS)及細胞因子的產生，從而保護細胞和組織免受炎癥損傷；分子伴侶作用[3]，參與蛋白質的折疊、轉運、聚集，促進變性蛋白質的消除，維持細胞的自穩(wěn)定。另外，HSP70還具有抗氧化、參與細胞周期調節(jié)及信號傳導等多種功能[4、5]。 應激反應時，HSP70表達明顯增加，并且由于應激源性質及應激持續(xù)時間的差異，其

3、表達也具有時序性與區(qū)域性。有研究表明[6、7]，大鼠外傷性腦損傷后，大腦、小腦、腦干等部位在15min內HSP70mRAN表達迅速增加，在6h內雖有所降低但仍保持較高水平，而高熱可以使大鼠下丘腦、內側疆核、齒狀回細胞內HSP70mRNA表達顯著增加，但在基底神經節(jié)和腦干神經元內則幾乎無HSP70表達。同時，年齡對HSP70表達的影響已有一些文獻報道。在體外實驗中，老化細胞的HSP70表達下降，Nitta[8]等證實，晚期的人類二倍體成纖

4、維細胞、T細胞在熱休克反應時HSP70表達比早期細胞要少，且HSP70的表達減弱發(fā)生在轉錄水平。在體內實驗中[9]，老年鼠的皮膚、肺及腦在熱應激時HSP70誘導減弱。因此，隨著年齡的增加，細胞合成HSP70的能力降低，可能是衰老機體對應激耐受力逐漸降低的原因之一。 生活在社會群體中的人們無論在生活還是在工作、學習過程中都要面對各種壓力，接受各種刺激，產生機體的應激反應。應用動物模型研究應激作用機制、對機體產生的影響及其保護機制，

5、對于研究如何緩解應激狀態(tài)，降低機體損傷等具有積極意義。 本次實驗采用不同強度強迫游泳刺激對不同月齡大鼠建立動物模型。青年大鼠和老年大鼠兩大組別的實驗動物各自隨機分組后，分別應用4℃冰水和25℃溫水實施急、慢性應激刺激。在慢性應激時，兩大組各隨機選取一組為應激習慣化組，同時選取未刺激組作為對照組，分別在應激后0mim、30min、1h、3h、6h處死動物取海馬組織，應用RP-PCR測定大鼠海馬HSP70mRNA的表達，從分子水平檢

6、測應激后HSP70與基礎水平的差異。應用放射免疫測定法測定外周血糖皮質激素的含量變化，觀察應激對動物激素水平的的影響；用open-field法測定應激強度、衰老對動物行為改變的影響。通過上述研究，進一步探討：(1)急、慢性應激時HSP70表達的時序性及其在機體的保護機制中所起作用的異同，(2)在低強度慢性應激作用下海馬HSP70表達是否會出現(xiàn)習慣化(機體是否會出現(xiàn)適應性反應)。當動物出現(xiàn)習慣化時改變應激源強度，對機體反應的影響。(3)觀

7、察不同年齡動物應激反應時HSP70mRNA表達量的差異，探討衰老對海馬HSP70表達及機體應激反應的強度及適應能力的影響。實驗結果如下： 1.慢性強迫游泳應激對不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達的影響：大鼠海馬HSP70mRNA表達在刺激后表達增加，但隨時間的延長表達逐漸減少。25℃溫水強迫游泳8天后，青年組和老年組大鼠在不同時段海馬HSP70mRNA表達與對照組存在顯著差異(P＜0.01)，不同年齡組大鼠HSP70mRNA

8、表達在不同時段存在顯著差異(P＜0.01)。 2.不同應激強度和時程對大鼠海馬HSP70mRNA表達的影響：采用4℃冰水(1天)和25℃溫水(8天)對大鼠實施急、慢性刺激。實驗組和對照組大鼠在不同時段海馬HSP70mRNA表達存在顯著差異(P＜0.01)，急性應激組大鼠HSP70mRNA表達在各個時點明顯高于慢性應激應激組大鼠(P＜0.01)，隨時間延長HSP70mRNA表達逐漸減少。 3.慢性應激習慣化及去習慣化后大鼠

9、海馬HSP70mRNA表達的改變：采用25℃溫水強迫游泳8天建立慢性應激習慣化組；25℃溫水強迫游泳7天后給予4℃冰水強迫游泳建立去習慣化組，兩組大鼠實驗指標與對照組比較在各個時點存在顯著性差異，兩實驗組大鼠海馬HSP70mRNA表達在應激后不同時段存在顯著差異(P＜0.01)，隨時間延長，HSP70mRNA表達量減少。 4.不同應激時程對不同月齡大鼠血清皮質醇含量的影響：不同應激強度對相同月齡大鼠血清皮質醇含量有影響，但差異無

10、顯著性；相同應激方式對不同月齡大鼠血清皮質醇含量在不同時段影響有顯著性差異。不同月齡大鼠應激后在30分鐘左右皮質醇含量增高較為明顯，隨時間延長而逐漸降低。 5.慢性應激習慣化及去習慣化后不同月齡大鼠行為的變化：通過記錄不同月齡大鼠在曠場實驗中的跨格數(shù)、直立次數(shù)、中央格停留時間、修飾次數(shù)和糞便粒數(shù)來觀察大鼠行為學方面的改變。結果顯示：不同月齡大鼠慢性應激習慣化組與去習慣化組在直立次數(shù)、跨格數(shù)和修飾次數(shù)三個行為學指標與對照組比較有顯

11、著性差異(P＜0.01)，中央格停留時間和糞便粒數(shù)變化差異無顯著性。 結論： 1.慢性強迫游泳應激對不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達的影響：青年組和老年組大鼠強迫游泳應激8天后，海馬HSP70mRNA表達與對照組相比明顯升高。青年組HSP70mRNA表達在應激后60分鐘左右達高峰，以后逐漸降低；老年組在30分鐘左右達高峰，以后逐漸降低，6小時后接近正常水平。提示機體受到慢性應激刺激后出現(xiàn)保護性反應，引起HSP70m

12、RNA轉錄增加，但隨時間延長HSP70mRNA生成逐漸減少。青年組在應激后各個時段HSP7mRNAO表達均明顯高于老年組，提示衰老是影響機體應激反應能力的因素之一。 2.不同應激強度與時程對不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達的影響：急、慢性應激都導致不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達增加，但急性應激組大鼠HSP70mRNA轉錄在多個時點均顯著高于慢性應激組大鼠，提示應激時程的改變可以引起HSP70mRNA表達量發(fā)生變化，

13、且隨應激源強度的增強，表達量增加。 3.應激習慣化及去習慣化后大鼠海馬HSP70mRNA表達的改變：重復強迫溫水游泳應激引起大鼠HSP70mRNA表達習慣化，再給予4℃冰水強迫游泳刺激，可引起HSP70mRNA在各個時點表達顯著增強，提示重復低強度應激能引起機體的習慣化反應，即對應激源的適應性反應，此后改變應激源的強度則可以逆轉低強度應激引起的習慣化效應，伎機體產生去習慣化反應，當機體在重復低強度應激的基礎上再次受到強烈刺激，產

14、生強烈反應，但反應水平低于急性應激反應水平。 4.大鼠血清皮質醇含量改變：急、慢性應激都引起大鼠血清皮質醇含量增加，但應激時程的改變對相同月齡大鼠血清皮質醇含量改變的影響差異無顯著性；相同應激時程則引起不同月齡大鼠血清皮質醇含量明顯增加，青年組大鼠在多個時點皮質醇含量明顯高于老年組，差異有顯著性。皮質醇作為應激激素，其含量升高表明機體處于應激狀態(tài)，且隨應激水平的升高而發(fā)生改變。 5.大鼠行為學方面的改變：慢性應激及應激習