液相芯片技術(shù)在病毒性腦炎診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、病毒性腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中最為常見(jiàn)的疾病之一，其進(jìn)展迅速，致死致殘率高，且由于缺乏明確的診斷方法，給治療上帶來(lái)不少難題。不少患者雖然進(jìn)行抗病毒治療，卻因不能確診病毒性腦炎或具體由哪一種病毒引起，因此不能有效、及時(shí)、準(zhǔn)確的進(jìn)行針對(duì)性治療。為降低該類疾病的死亡率并提高生存率，這就要求臨床上對(duì)導(dǎo)致疾病的病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定。目前的檢測(cè)方法（如病原體培養(yǎng)、ELISA檢測(cè)、生化檢測(cè)等）費(fèi)時(shí)費(fèi)力或價(jià)格昂貴，且每次測(cè)試只能檢測(cè)一種病原體

2、，不能達(dá)到同時(shí)檢測(cè)幾種病原體的要求。
　　目的：本研究的目的是通過(guò)Luminex200懸浮陣列系統(tǒng)，建立一種新的多重PCR快速準(zhǔn)確的診斷平臺(tái)，可高靈敏度、高特異性的同時(shí)檢測(cè)幾種病原體。這個(gè)平臺(tái)相較于傳統(tǒng)的分離鑒定病原學(xué)方法，將會(huì)提供更經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)，更及時(shí)以及更全面的病原學(xué)信息。方法：本研究以病毒性腦膜炎和腦炎最為常見(jiàn)的5種病原體（EV71病毒,CA16病毒，ECHO病毒，乙腦病毒以及EB病毒）為研究對(duì)象。通過(guò)查找GenBank獲得5

3、種病原體的特異性基因，用oligo6對(duì)其保守序列進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)及探針設(shè)計(jì)，后BLAST比對(duì)篩選，確保所選用的引物及探針特異準(zhǔn)確。選用可在液相中懸浮的獨(dú)特顏色編碼微球，共價(jià)耦合生物體特定的捕獲探針，通過(guò)探針捕獲檢測(cè)特定病原體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（引物已用生物素標(biāo)記），將SAPE（鏈霉親和素-R-藻紅蛋白）與生物素結(jié)合后，即可用Luminex200機(jī)器檢測(cè)，最后用臨床標(biāo)本評(píng)價(jià)其可行性。結(jié)果：通過(guò)單重PCR體系驗(yàn)證5種病原體引物的正確性后，進(jìn)行

4、多重PCR體系的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件為58℃，40循環(huán)。同時(shí)，優(yōu)化上機(jī)檢測(cè)的最佳雜交條件為55℃，15min。目前，可同時(shí)對(duì)EV71病毒、ECHO病毒、柯薩奇A16病毒、乙腦病毒、EB病毒進(jìn)行5重檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一致，特異性為100％。我們同時(shí)進(jìn)行了44例臨床標(biāo)本的檢測(cè)，其中EB病毒感染7例，乙型腦炎2例，腸道病毒感染35例，檢測(cè)結(jié)果與診斷基本相符，符合率達(dá)到97％。結(jié)論：基于Luminex200懸浮陣列系統(tǒng)的多重PCR