肝素寡糖的制備、結(jié)構(gòu)分析及其抗哮喘分子作用機制研究.pdf

1、肝素(Heparin)屬于糖胺聚糖類化合物，分子中主要由糖醛酸(艾杜糖醛酸和葡糖醛酸)和葡糖胺以及它們的硫酸化和乙?；难苌镆?→4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖鏈化合物，Mr分布范圍3kD～30kD。肝素寡糖是采用不同降解方法降解肝素獲得的平均Mr在1kD～4kD的寡糖片段。不同降解方法所得肝素寡糖具有不同的結(jié)構(gòu)，從而具有不同的生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)肝素除了具有抗血栓和抗凝血活性外，還具有抑制平滑肌增生、抗炎癥、抗腫瘤等生物學(xué)功能。

2、 哮喘是一種多炎癥細胞、介質(zhì)和細胞因子參與的慢性炎癥性氣道疾病，伴有氣道高反應(yīng)性和氣道阻塞癥狀。白細胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)和白細胞介素-5(Interleukin-5，IL-5)是哮喘炎癥過程發(fā)生的重要因子。哮喘病的一個重要特征就是IgE的增高，IgE能結(jié)合炎癥細胞，在過敏原誘導(dǎo)下這些炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，從而增強氣道高反應(yīng)性。 炎癥過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是炎癥發(fā)生的重要途徑，核轉(zhuǎn)錄因子-кB(Nuclea

3、rfactor-кB，NF-кB)能調(diào)控炎性蛋白的合成，參與哮喘的炎癥反應(yīng)。 本課題探討了不同結(jié)構(gòu)的肝素寡糖對哮喘炎癥中的炎癥因子的表達和活性的影響。此外，還研究了肝素寡糖與IL-4和IL-5的結(jié)合情況以及導(dǎo)致IL-4和IL-5二級結(jié)構(gòu)的變化。 1肝素寡糖的制備和純化 不同方法降解的肝素寡糖用Superdex30凝膠層析柱分離，獲得相對分子質(zhì)量(Mr)分布范圍不同的寡糖組分，初次分離的組分OligNO.8、Oli

4、gHO.6與OligBH.7用Superdex30凝膠層析柱進行二次分離，再經(jīng)過QSepharoseTMFastFlow強陰離子交換柱層析和SpherisorbSAX離子交換柱層析進行分離，從而獲得組成相對單一的組分，在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中顯示單一條帶。 2肝素寡糖的結(jié)構(gòu)分析 利用紅外光譜(IR)、核磁共振光譜(1H-NMR、13C-NMR)和雙糖分析結(jié)果確定三種寡糖的主要分子結(jié)構(gòu)。紅外光譜結(jié)果顯示，Olig

5、NO.8、OligHO.6與OligBH.7結(jié)構(gòu)中含有羥基和羰基，OligNO.8組分中含有酰胺結(jié)構(gòu)。三種肝素寡糖組分的糖鏈中都含有UA/△UA(2S)、GlcNS(6S)、IdoA(2S)和GlcNS/GlcNAc，只是在不同的寡糖中各種單糖的含量不同，核磁共振光譜和雙糖分析結(jié)果證明了這一結(jié)論。OligBH.7用肝素酶酶解后的主要雙糖結(jié)構(gòu)是α-△UA-2S-[1-4]-GlcNS，α-△UA-[1-4]-GlcNS-6S，α-△UA-

6、2S-[1-4]-GlcNS-6S。OligHO.6和OligNO.8用肝素酶酶解后的主要雙糖分別是α-△UA-2S-[1-4]-GlcNS-6S，α-△UA-[1-4]-GlcN和α-△UA-[1-4]-GlcN。 3肝素寡糖對哮喘相關(guān)細胞因子分泌的影響 建立小鼠哮喘模型，小鼠肺組織病理學(xué)切片觀察肺內(nèi)炎癥情況。結(jié)果顯示，三種肝素寡糖具有減輕炎癥反應(yīng)和治療肺組織炎癥病變的作用。研究了三種肝素寡糖對哮喘小鼠脾淋巴細胞分泌細

7、胞因子IL-4、IL-5的影響。結(jié)果顯示，哮喘小鼠脾淋巴細胞中IL-4、IL-5表達增加，其中哮喘組淋巴細胞培養(yǎng)上清液中mIL-4和mIL-5含量分別為32.93±2.13pg/mL和52.83±3.82pg/mL，明顯高于正常對照組(0.57±0.07pg/mL和8.30±0.54pg/mL，p＜0.05)。三種肝素寡糖用藥組mIL-4含量分別是OligBH組1.77±0.70pg/mL，OligNO組2.41±0.62pg/mL，O

8、ligHO組6.42±0.65pg/mL，與致敏哮喘組比較，三種寡糖藥物治療組對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-4有顯著的抑制效果(p＜0.05)，其中OligBH抑制效果最強。三種寡糖用藥組mIL-5表達含量分別為：OligHO組12.04±0.27pg/mL，OligNO組12.53±0.73pg/mL，OligBH組10.60±0.22pg/mL，與哮喘組比較具有顯著性差異(p＜0.05)。三種寡糖組之間兩兩比較，無顯著性差異(p＞0.0

9、5)。 4肝素寡糖對哮喘相關(guān)炎癥因子表達的影響 研究了肝素寡糖對與哮喘相關(guān)的炎癥因子IgE的分泌、CD23和NF-кBp65表達的影響。對IgE分泌量的影響試驗結(jié)果顯示，哮喘小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)液中的IgE的含量為102.20±6.79ng/mL，而正常對照組為7.92±0.46ng/mL，三種寡糖治療組IgE的含量分別為：OligHO治療組15.03±3.62ng/mL，OligNO治療組21.20±2.59ng/mL，

10、OligBH治療組12.20±1.87ng/mL，與哮喘組比較三種寡糖治療組對IgE表達均具有顯著的抑制作用(p＜0.05)，說明三種肝素寡糖能有效地抑制小鼠脾淋巴細胞分泌IgE。OligBH治療組對IgE表達抑制作用最強，OligNO組的抑制效果最弱。 對小鼠脾淋巴細胞CD+23表達的影響試驗結(jié)果顯示，致敏哮喘組小鼠脾淋巴細胞CD+23表達率為(59.82±3.69)％，而正常對照組為(4.72±0.45)％，OligBH、O

11、ligNO、OligHO三種寡糖治療組CD+23表達率分別為：(6.20±0.80)％、(18.92±0.79)％和(21.22±1.81)％，明顯低于哮喘陽性對照組(p＜0.05)。OligBH對CD+23表達的抑制作用強于OligHO與OligNO。 采用免疫組化法測定哮喘模型小鼠肺組織中NF-кBp65的表達。結(jié)果顯示，致敏哮喘組小鼠肺組織NF-кBp65陽性率為(45.84±9.51)％，與正常組(7.46±2.52)％

12、比較，哮喘小鼠肺組織中NF-кBp65的表達顯著提高(p＜0.05)。三種寡糖用藥組中NF-кBp65陽性率分別為：OligNO組(15.52±1.98)％，OligHO組(27.08±6.62)％，OligBH組(12.32±0.96)％，與哮喘組比較具有顯著性差異(p＜0.05)，接近正常組表達水平。三種肝素寡糖治療組中NF-кBp65的表達被明顯抑制。 綜上所述，肝素寡糖對炎癥過程中炎性蛋白，受體以及轉(zhuǎn)錄因子的表達均有抑制

13、作用，從而抑制哮喘炎癥的發(fā)生。 5肝素寡糖對哮喘相關(guān)細胞因子構(gòu)象的影響 采用ELISA法測定寡糖與細胞因子的結(jié)合，結(jié)果顯示肝素寡糖能與細胞因子IL-4和IL-5結(jié)合，再利用衰減全反射傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(ATR-FTIR)觀察細胞因子蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示肝素寡糖與IL-4、IL-5結(jié)合后引起IL-4、IL-5的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使IL-4和IL-5分子的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋構(gòu)象和β-構(gòu)象所占的比例發(fā)生改變。