肝素對星形膠質(zhì)細胞的活化作用及其機制研究.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞主要對神經(jīng)元起支持作用。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷，如外傷、局部缺血和缺氧等，星形膠質(zhì)細胞會由靜息態(tài)進入活化態(tài)，即發(fā)生星形化，從而參與突觸形成和神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)。在急性損傷期，活化的星形膠質(zhì)細胞發(fā)揮著重要的作用，它不但能夠提供營養(yǎng)因子，促進神經(jīng)再生，還能將損傷區(qū)與正常組織進行隔離，防止損傷面積的擴大。但是，當損傷進入慢性期，以活化星形膠質(zhì)細胞等為主要成分的膠質(zhì)瘢痕會成為神經(jīng)再生的機械性屏障，不利于神經(jīng)損傷的修復

2、。因此，星形膠質(zhì)細胞活化的具體機制成為神經(jīng)損傷修復治療中的一個關(guān)鍵內(nèi)容。
　　 肝素，是星形膠質(zhì)細胞發(fā)生活化時分泌量出現(xiàn)增長的細胞外基質(zhì)之一，本研究利用肝素的這一性質(zhì)，將其作用于大鼠原代星形膠質(zhì)細胞，從形態(tài)、增殖和遷移的角度證實肝素誘導星形膠質(zhì)細胞活化的性質(zhì)，制備能夠模擬體內(nèi)活化且程度可控的體外模型，并進一步探究誘導星形膠質(zhì)細胞發(fā)生活化的內(nèi)在分子機制，為神經(jīng)損傷治療的有效進行提供實驗依據(jù)。本文的主要內(nèi)容如下:
　　 1、

3、原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)及純化。以經(jīng)典的McCarthy法為基礎(chǔ)，取新生大鼠的大腦皮層，消化后得到星形膠質(zhì)細胞懸液，培養(yǎng)10天后通過搖床過夜振搖的方法去除生長在星形膠質(zhì)細胞上層的少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。為了提高星形膠質(zhì)細胞的純度，我們在接種細胞時采取差速黏附的方法減少成纖維細胞的污染，經(jīng)過免疫熒光染色鑒定，培養(yǎng)細胞的GFAP陽性率從80％上升至95％以上，滿足了后續(xù)實驗對細胞純度的要求。
　　 2、肝素對星形膠質(zhì)細胞活化作用的研

4、究。首先，通過伊紅染色和GFAP免疫熒光染色的方法檢測星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式促進細胞骨架發(fā)生重組，細胞由多角形的靜息態(tài)向星形的活化態(tài)轉(zhuǎn)變;隨后的WesternBlotting結(jié)果顯示，肝素可以提高星形膠質(zhì)細胞中GFAP的表達量，進而證實肝素聯(lián)合FGF-2能夠誘導星形膠質(zhì)細胞發(fā)生活化。然后，通過BrdU摻入法和流式細胞術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞的增殖情況，結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式增加發(fā)

5、生DNA復制的細胞比例，而且能夠促進細胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，提高細胞的增殖率。最后，通過Transwell小室法檢測星形膠質(zhì)細胞的遷移情況，結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2提高了星形膠質(zhì)細胞的遷移能力。
　　 3、星形膠質(zhì)細胞活化的機制研究。通過抑制劑篩選、WesternBlotting和PCR等方法檢測參與調(diào)控星形膠質(zhì)細胞活化的信號通路，結(jié)果顯示MAPK中的ERK和PI3K/Akt信號通路以及細胞膜上的N-鈣粘素參與了肝素對星形膠