不同結(jié)構(gòu)的肝素來源寡糖的制備及其抗哮喘作用機(jī)制的研究.pdf

1、肝素(heparin)是一類分布廣泛的硫酸化程度較高的糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)類生化藥物，主要由糖醛酸和葡糖胺及其衍生物通過1，4-糖苷鍵交替連接形成，其主要重復(fù)的雙糖單位為-[-a-L-IdoA-2-SO4-β(1→4)-a-D-G1cNSO,3>-6-SO<,4>-]-。近年來研究發(fā)現(xiàn)肝素類物質(zhì)對(duì)哮喘具有治療作用，且該治療作用大部分是基于其抗炎作用。肝素及其衍生物的抗炎、抗哮喘作用主要是依賴于其聚陰

2、離子特性和結(jié)構(gòu)的可變性，它們能通過離子結(jié)合力與體內(nèi)帶正電荷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子結(jié)合，或者與寡糖配體結(jié)合，發(fā)揮其抗炎和抑制氣道高反應(yīng)性的作用。肝素作為抗凝劑，用于治療哮喘會(huì)帶來出血的副作用，將肝素用不同方法降解制成低分子肝素，或硫酸化成多硫酸化肝素，能降低其抗凝活性，減少副作用。 為了研究多硫酸肝素寡糖的結(jié)構(gòu)與其抗哮喘作用的關(guān)系，本課題研究了三種不同方法降解多硫酸肝素的可行性，經(jīng)過降解和分離純化后制得低分子多硫酸肝素寡糖LPSH-

3、3、LPSH-4和低分子肝素寡糖LMWH8-1，并分析了它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。為進(jìn)一步探討其治療哮喘的作用機(jī)制，本研究采用熒光定量PCR法測定哮喘小鼠給藥前后淋巴細(xì)胞IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量，探討多硫酸寡糖對(duì)炎癥因子分泌影響的分子機(jī)制。運(yùn)用免疫組化方法測定哮喘小鼠給藥前后肺組織NFATp的表達(dá)，研究了多硫酸寡糖影響白介素分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 本研究取得的結(jié)果和結(jié)論有一下幾個(gè)方面：國家自然基金資助項(xiàng)目(No 3

4、0370613) (1)以Superdex 30凝膠層析分離純化獲得了分子量和帶電量比較單一的低分子肝素寡糖LMWH8-1。將肝素硫酸化所得多硫酸肝素(PSHP)經(jīng)亞硝酸降解、過氧化氫降解、β消除法降解得到的產(chǎn)物。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析顯示，β消除法降解PSHP比較困難，亞硝酸降解法則會(huì)降低PSHP的硫酸根含量。過氧化氫可以降解PSHP。在得到過氧化氫降解產(chǎn)物后分離純化獲得了分子量比較單一的低分子多硫酸肝素寡糖LPSH-3和LPSH-4。

5、 (2)通過對(duì)各樣品的紫外(UV)光譜、紅外(IR)光譜、核磁共振光譜(<'13>C-NMR，<'1>H-NMR)及質(zhì)譜(MS)等的結(jié)果分析。確定了LMWH8-1、LPSHP-3和LPSHP-4的分子結(jié)構(gòu)，LMWH8-1為△U<,4,5>2S-Glc6S-IdoA2S6S-Glc，LPSH-3為 O=CH-CH<,2>-GlcNS3S6S-IdoA2S3S-GlcNAc3S ，LPSH-4為GlcA-GlcNAc6S-Ido

6、A2S-GlcNAc。 (3)通過熒光定量PCR法測定不同寡糖哮喘小鼠給藥前后淋巴細(xì)胞IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量。研究結(jié)果表明：LMWH8-1，LPSH-3和LPSH-4對(duì)mIL-4、mIL-5和mIL-13 mRNA的表達(dá)有顯著的抑制作用。LMWH8-1用藥組IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量分別是哮喘模型小鼠的0.212±0.113倍、0.044_±0.002倍、0.004±0.01倍；LPS

7、H-3用藥組IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量分別是哮喘模型小鼠的0.053±0.019倍、0.012±0.009倍、0.039±0.01倍；LPSH-4用藥組IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量分 別是哮喘模型小鼠的0.019±0.008倍、0.085±0.023倍、0.019±0.03倍。 (4)通過免疫組化方法測定哮喘小鼠給藥前后肺組織NFATp的表達(dá)，研究多硫酸寡糖影響白介素分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。試