結(jié)核分支桿菌高特異性分子信標設計及熒光芯片運用的初步研究.pdf

1、目前對結(jié)核分支桿菌(Bacillus Tuberculosis，TB)的檢測，主要靠痰涂片、培養(yǎng)及PCR檢測等技術(shù)，存在耗時長，敏感度低和特異性差等缺點，常常導致誤診和漏診，從而給病人帶來巨大的經(jīng)濟負擔。因此建立快速、敏感、簡便的結(jié)核分支桿菌鑒定檢測系統(tǒng)是目前國內(nèi)外實驗診斷學急需解決的問題，也是有效治療和控制該類致病菌的有效手段之一。本研究通過自行設計結(jié)核分支桿菌高特異性的分子信標，并以其為探針固定在芯片表面，從而將分子信標探針的高靈敏

2、性、高特異性優(yōu)勢運用于生物芯片領域，建立了一種快速鑒定結(jié)核分支桿菌的分子信標探針熒光芯片技術(shù)，為結(jié)核分支桿菌流行病學調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。 目的： 設計結(jié)核分支桿菌高特異性的分子信標并構(gòu)建分子信標探針型熒光芯片，建立快速鑒定結(jié)核分支桿菌的檢測技術(shù)。 方法： 1．根據(jù)GenBank找到結(jié)核分支桿菌基因序列，選擇序列號為IS986的基因序列，在Primer Premier V5.0軟件上設計結(jié)核分支桿菌特異

3、性引物。并對反應體系中MgCl<,2>、引物、dNTP濃度以及引物退火溫度優(yōu)化后建立結(jié)核分支桿菌PCR反應擴增體系。通過對TB標準株、TBI臨床分離株和臨床陽性標本擴增產(chǎn)物的直接測序、靈敏性試驗以及特異性試驗對PCR反應體系進行綜合評估。 2．從TB PCR反應體系的擴增片段內(nèi)部取一段序列設計，經(jīng)用beacon designer 2.1軟件分析設計分子信標。對反應體系中的分子信標探針、MgCl<,2>、引物以及dNTP的濃度進行

4、優(yōu)化后建立TB分子信標直接加入PCR擴增體系的雜交試驗。 3．通過對雜交溫度、雜交時間以及雜交方式的優(yōu)化，建立PCR反應后再加入TB分子信標雜交試驗。 4．運用熒光分光光度計和熒光顯微鏡對MB PCR雜交產(chǎn)物熒光信號的觀測條件進行摸索。并進行不同熒光一淬滅分子對標記分子信標的觀測試驗。 5．通過對傳統(tǒng)生物素(biotin)-親和素(avidin)連接方式和自行設計的單側(cè)延長臂的分子信標連接方式的對比研究，對TB分

5、子信標與芯片固定方式進行探索。 6．提高單側(cè)延長臂的分子信標芯片雜交效率部分優(yōu)化包括：5′寡核苷酸探針濃度；分子信標探針濃度及純度；雜交溫度、雜交時間、雜交液配方；點樣大小與點樣濃度對熒光信號檢測的影響；陰一陽性區(qū)分的臨界值。 7．TB-MB芯片的臨床應用和方法學比較。 主要結(jié)果： 1．TB PCR反應體系陽性擴增結(jié)果為在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)245bp的條帶。MgCl<,2>、引物以及dNTP在TB PC

6、R體系中優(yōu)化后最佳終濃度分別為：4mmol/L、0.04μmol/L以及0.3 mmol/L。TB PCR體系的退火溫度優(yōu)化后為55℃。TB標準株及TB臨床分離株和臨床陽性標本擴增產(chǎn)物的直接測序結(jié)果與GenBank中公布的序列完全一致。TB PCR反應體系對其它細菌無交叉反應。檢測限度為10拷貝/μl的DNA。 2．TB分子信標直接加入PCR擴增體系的TB分子信標、MgCl<,2>、引物以及dNTP最佳終濃度分別為：0.04μm

7、ol/L、5.0mmol/L、0.04μmol/L、0.3mmol/L。 3．PCR反應后再加入TB分子信標雜交試驗中水浴、PCR儀、恒溫搖床的最適雜交溫度和適雜時間分別為：55℃，6h；55℃，4h；50℃，7h。陰-陽性效果區(qū)分：水浴>恒溫搖床>PCR儀。 4．熒光分光光度儀檢測MB PCR雜交陽性產(chǎn)物、MB PCR雜交陰性產(chǎn)物(莖環(huán)結(jié)構(gòu)未打開)、無游離分子信標探針PCR產(chǎn)物(空白對照)三者的熒光光亮度比值為：6.1

8、02/0.136/0.003。熒光顯微鏡觀測MB PCR雜交陽性產(chǎn)物、MB PCR雜交陰性產(chǎn)物(莖環(huán)結(jié)構(gòu)未打開)熒光強度明顯區(qū)別。本試驗Cy3-BDH組成分子信標熒光-淬滅效率較Cy3-DABCLYE高，F(xiàn)AM-DABCLYE組成分子信標熒光-淬滅效率較FAM-BDH高。 5．生物素-親和素(biotin-avidin)能很好的結(jié)合在芯片上但這種修飾有相當技術(shù)難度；且生物素-親和素連接無特異性。本設計單側(cè)延長臂分子信標采用淬滅分

9、子中間標記，莖結(jié)構(gòu)單側(cè)(淬滅分子一側(cè))延長臂，能很好的結(jié)合在芯片上，且修飾技術(shù)難度低、特異性高。 6．單側(cè)延長臂分子信標芯片雜交效率的優(yōu)化結(jié)果：5′寡核苷酸探針最適濃度為40μmol/L。對較理想?yún)^(qū)分陰陽性的信號強度：Cy3-BDH熒光-淬滅分子對標記分子信標探針濃度約10μmol/L，而FAM-DABCLYE分子對標記分子信標探針濃度約15μmol/L，經(jīng)65℃雜交17h有較好的雜交效果。Cy3-BDH分子信標探針濃度約15μ

10、mol/L、FAM-DABCLE探針濃度約9μmol/L時雜交反應達到7h可檢測到較強信號。雜交液的雜交結(jié)果比較：0.15％SDS效果好于0.2％SDS，10xSSC效果好于5xSSC。樣本隨著點樣直徑的縮小，熒光強度不變；樣本隨著點樣濃度的倍比減小，熒光強度也減小。 7．TB-MB芯片提痰標本總檢出率為57.5％(23/40)，高于痰涂片27.5％(11/40)和培養(yǎng)35％(14/40)，經(jīng)統(tǒng)計學處理TB-MB芯片與痰涂片、培

11、養(yǎng)相比差異有顯著性(分別為x<'2>=7.366，P=0.006<0.01；x<'2>=32.281，P=0.000<0.01)。對照組20例，1例非結(jié)核分支桿菌病痰涂片、培養(yǎng)均陽性，TB-MB芯片陰性；其余19例均為陰性。 結(jié)論： 1．TB-MB PCR反應體系能夠快速對TB標準株、TB臨床分離株及臨床標本進行結(jié)核分支桿菌的鑒別；相對普通PCR檢測具有更高的特異性和靈敏性，．為結(jié)核分支桿菌高特異性分子信標熒光芯片的檢測

12、方法的建立奠定了基礎。 2．單側(cè)延長臂分子信標探針設計的發(fā)明及運用，初步解決了分子信標技術(shù)在芯片技術(shù)領域運用的固定難題。巧妙地把分子信標高特異性、高靈敏性等優(yōu)勢自然運用到芯片技術(shù)上。 3．建立起結(jié)核分支桿菌分子信標熒光芯片的檢測技術(shù)，包括樣本制備、芯片制備、雜交反應以及掃描和圖像分析等方法。并兼顧到各種因素對單側(cè)延長臂分子信標芯片的影響，對反應體系中各條件進行了合理的優(yōu)化，使所建立的檢測體系穩(wěn)定可靠。 4．通過與