過敏原特異性IgE檢測芯片的研制及初步應用.pdf

1、Ⅰ型變態(tài)反應是一種IgE水平異常增高的疾病狀態(tài)，涉及兒科、內科、耳鼻喉科和皮膚科等多個學科，嚴重者可以引起過敏性休克甚至死亡。世界上大約有1/4的人飽受I型變態(tài)反應困擾。近幾年，隨著生活環(huán)境和生活方式的改變，新的變應原不斷出現(xiàn)，發(fā)病率日漸增多。過敏原的檢測可以在早期識別敏感病人，決定后續(xù)預防與治療措施。目前對過敏原的體外檢測方法(FAST、ELISA)操作繁瑣、費時，每次只能檢測一種或者少數(shù)幾種過敏原，而作為常規(guī)檢測的過敏原有200余種

2、，這給臨床醫(yī)生在選擇檢測項目和具體操作時帶來困難。 目的：研制一種可同時檢測18種過敏原特異性IgE的蛋白質芯片，并初步應用于臨床檢測，為將來給臨床提供一種高效實用的過敏原特異性IgE檢測技術與方法奠定基礎。 方法：1.過敏原提取液原液的蛋白濃度測定與濃縮處理；2.以多聚賴氨酸處理玻片、甲醇處理PVDF膜片、PBS處理硝酸纖維素膜片和尼龍膜片為固相載體，制備不同基片的芯片，對海魚特異性IgE陽性的同一標本進行檢測，根據(jù)檢

3、測結果優(yōu)選固相基片；3.分別以戊二醛、乙醇和丙酮作為化學藥物交聯(lián)劑，對過敏原點樣后的固定條件進行優(yōu)化；4.用L16(44×23)正交法對芯片制備及使用條件進行優(yōu)化。Scanarray4000激光共聚掃描儀成像，Quantarray軟件分析熒光強度；5.根據(jù)上述結果制備可同時檢測18種過敏原的蛋白質芯片并對芯片的檢測靈敏性、重復性和穩(wěn)定性進行檢測；6.本芯片和IVT試劑盒對138份標本進行對比檢測，SPSS統(tǒng)計分析軟件分析檢測結果。

4、 結果：選擇硝酸纖維素膜為固相基片，制備條件與過程為：1)配制過敏原點樣液；2)點樣后37℃濕盒中固定2h；3)0.1％戊二醛室溫下化學固定0.5h；4)洗膜；5)2％BSA37℃濕盒中封閉2h。 使用條件及步驟：1)1：8稀釋待檢血清后與芯片37℃濕盒中雜交2h；2)洗膜；3)加2.5μg/mL生物素37℃濕盒中孵育1h；4)1.25μg/mL親和素37℃濕盒中孵育1h；5)洗膜、干燥后掃描。 芯片的檢測靈敏性、重復

5、性、穩(wěn)定性好，血清稀釋128倍仍可檢測到特異性IgE的存在。與IVT試劑盒進行比較，兩種方法對雞蛋、海魚、大豆、花生、大籽蒿花粉等大部分過敏原的檢出率無差異(x2檢驗p＞0.05)，陽性檢測符合率為60.19％。 結論：過敏原特異性IgE檢測芯片，將目前對過敏原特異性IgE的單一檢測(或少數(shù)幾種的檢測)變?yōu)槎喾N同時檢測，具有樣本用量少、檢測指標多、操作簡便、價格低廉等優(yōu)點。這是國內首次應用蛋白質芯片技術對多種過敏原進行檢測。該方