結(jié)核分枝桿菌特異性抗原-抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的初步研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的—種慢性傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WI-IID)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前全球約有1/3的人感染了結(jié)核桿菌，每年死于結(jié)核病的人數(shù)達(dá)到300萬。我國結(jié)核桿菌感染率為44．5％，活動(dòng)性肺結(jié)核患者451萬，每年死亡人數(shù)達(dá)13萬。結(jié)核病成了危害^類健康的重要傳染病之一。對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究再度成為了全球研究的熱點(diǎn)。要控制結(jié)核病的流行與蔓延的關(guān)鍵在于找到簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法。 1998年結(jié)核分枝桿菌基因組破譯

2、成功，運(yùn)用基因組雜交技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)的基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)卡介苗(BCG)相比于結(jié)核分枝桿菌，有16個(gè)基因差異的區(qū)域(Region of Difference，RD)，包括RD1-16，其中的RD1區(qū)是僅存在于致病性分枝桿菌包括^型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、非洲分枝桿菌及某些非典型分枝桿菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝桿菌中。RD1區(qū)基因所編碼的蛋白在結(jié)核分枝桿菌疫苗研制開發(fā)和檢驗(yàn)診斷方面都受到了廣

3、泛的關(guān)注。CFP10、ESAT6和PPE68的編碼基因均存在于RD1區(qū)，且具有強(qiáng)烈的免疫原性，因此可將ESAT6、CFP10和PPE68作為診斷結(jié)核桿菌感染的特異性試劑。由于單一蛋白在診斷上靈敏度不理想，目前有很多學(xué)者認(rèn)為兩個(gè)或多個(gè)特異性蛋白的聯(lián)合，有利于提高檢測(cè)的靈敏度。 本研究構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pGcfp10、pGesat6、pGcfp10-esat6以及pGesat6-ppe68，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中高效表達(dá)，通過

4、純化試劑盒獲得純化的重組蛋白ESAT6、CFPl0-ESAT6和ESAT6-PPE68，將三種純化蛋白免疫動(dòng)物，獲得了高效價(jià)的多克隆抗體血清。以結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)為參考，在建立PPD-ELISA的基礎(chǔ)上，建立了以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68為包被抗原檢測(cè)結(jié)核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，旨在為臨床結(jié)核病的診斷提供敏感性、特異性和實(shí)用性都比較理想的診斷試劑，為我國結(jié)核病的防治提供

5、技術(shù)支持。為了能進(jìn)一步診斷病人是否為現(xiàn)癥感染，本實(shí)驗(yàn)建立了以多克隆抗體作為包被抗體檢測(cè)結(jié)核病人血清中特異性抗原的雙抗體夾心ELIISA檢測(cè)方法，為結(jié)核病的早確診、早治療提供了一種新的技術(shù)思路。本研究共分五部分進(jìn)行： 第一部分，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv國際標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，采用常規(guī)PCR法擴(kuò)增出303 bp的cfp10基因和288 bp的esat6基因，隨后將其分別定向連接入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)重組

6、質(zhì)粒pGcfp10和oGesat6，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，約36 kDa的GST-CFP10和約32 kDa的GST-ESAT6融合蛋白在原核系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)，并將GST-ESAT6融合蛋白通過谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白純化試劑盒得到純化。 第二部分，用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接(GeneSOEing)法擴(kuò)增cfp10-esat6 融合基因，并將其定向克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGcfp10-esat6

7、，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)約42 kDa帶GST標(biāo)簽的重組CFP10-ESAT6融合蛋白，經(jīng)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白純化試劑盒得到純化的融合蛋白。 第三部分，采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接(CeneSOEing)法實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌esat6及ppe68基因融合，融合基因esat6-ppe68被克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1中，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGesat6-ppe68，并使約69 kDa的GST-ESAT6-PPE68融合蛋白

8、在原核系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)，經(jīng)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白純化試劑盒得到純化的融合蛋白。 第四部分，將構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGesat6、pGcfp10-esat6、pGesat6-ppe68分別在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)帶GST標(biāo)簽的融合蛋白，采用谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白純化試劑盒獲得大量高度純化的融合蛋白，并將部分純化蛋白免疫動(dòng)物，制備高效價(jià)的多克隆抗體血清。 第五部分，以結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(P

9、PD)為包被抗原，通過對(duì)血清稀釋度、封閉液、底物作用時(shí)間及陰陽判定方法等方面的摸索，建立了優(yōu)化后的PPD-ELISA程序，參考此方法，分別建立了以結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68為包被抗原檢測(cè)結(jié)核病人血清中特異性抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。通過與PPD-ELISA進(jìn)行比較，認(rèn)為三種特異性抗體ELISA檢測(cè)方法在對(duì)結(jié)核病的診斷上顯示了更高的特異性，將特異性抗體ELISA檢測(cè)方法用于復(fù)檢PP

10、D-ELISA陽性的病人，將有利于提高結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性。通過比較三種特異性抗體EIISA檢測(cè)方法的特異性與靈敏度，認(rèn)為兩融合蛋白-ELISA的敏感性高于單一蛋白ESAT6-ELISA，兩融合蛋白-EIJSA之間的敏感性無差異，但CFP10-ESAT-ELISA的特異性高于ESAT6-PPE68-ELISA，三種特異性抗體ELISA檢測(cè)方法以CFP10-ESAT6-E12SA效果最好，PPE68也是很有研究?jī)r(jià)值的結(jié)核特異性診斷抗原。本部

11、分研究還建立了以包被多克隆抗體檢測(cè)結(jié)核特異性抗原的雙抗體夾心ELISA方法，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三種方法的靈敏度均較低，分別為12％、18％、19％，但特異性很高，接近100％，認(rèn)為以結(jié)核特異性抗體來檢測(cè)病人血清中的結(jié)核特異性抗原的ELISA檢測(cè)方法是一種診斷病人是否為結(jié)核現(xiàn)癥感染的可行的新技術(shù)方法。 綜上所述，檢測(cè)結(jié)核特異性抗體的ELISA方法用于結(jié)核病的檢測(cè)具有敏感性較高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可望開發(fā)成診斷試劑盒，滿足目前臨床上結(jié)核病診