結(jié)核分枝桿菌特異性抗原在實(shí)驗(yàn)猴結(jié)核感染診斷中的應(yīng)用與初步評價.pdf

1、目的:
　　 通過呼吸道接種恒河猴結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)建立結(jié)核病模型，利用該模型首先進(jìn)行不同結(jié)核菌素敏感性和耐受性研究，并探討連續(xù)高頻次結(jié)核菌素試驗(yàn)(Tuberculin skin test，TST)對結(jié)核感染免疫診斷的影響。借助該模型對特異性抗原進(jìn)行篩選，結(jié)合自然感染猴血清的診斷結(jié)果，確定特異性抗原在結(jié)核病感染猴免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。
　　 方法:
　　 1.恒河猴結(jié)核感染模型的建立
　　 4只

2、恒河猴通過呼吸道接種結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)，每2只一個劑量組，分別接種50 CFU/只和500 CFU/只H37Rv，從臨床癥狀、眼瞼和腹部皮膚TST、血細(xì)胞變化、免疫膠體金檢測、抗體動態(tài)變化、血漿細(xì)胞因子變化、組織病理變化和組織載菌量等方面對模型作出評價。
　　 2.TST在結(jié)核感染猴的評價研究
　　 利用恒河猴結(jié)核病感染模型，進(jìn)行TST檢測研究。比較3種國產(chǎn)結(jié)核菌素和哺乳類舊結(jié)核菌素的敏感性和特異性，觀察連續(xù)試驗(yàn)

3、引起的敏感性、特異性和耐受性變化。同時設(shè)立無結(jié)核病健康猴作為對照。
　　 3.結(jié)核分枝桿菌特異性抗原在血清學(xué)診斷中的篩選
　　 建立結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(PPD-1、PPD-J和重組蛋白CFP10、Ag85b、MPT64L、CFP10-ESAT-6、38kDa、U1/TPX、16kDa、ESAT-6、14kDa、TB16.3等12種抗原)的抗體ELISA法，利用恒河猴結(jié)核病感染模型對上述蛋白抗原進(jìn)行比較研究，初步篩選出

4、適用于結(jié)核病診斷的蛋白抗原。同時設(shè)立連續(xù)TST刺激的健康猴作為對照，研究高頻次TST對抗體檢測的影響。
　　 4.結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的臨床初步應(yīng)用與評價
　　 利用建立的血清抗體檢測方法，對自然感染結(jié)核病猴和TST陰性猴進(jìn)行檢測，獲得相應(yīng)抗體的OD450值，借助ROC曲線分析獲得各抗原的敏感性和特異性。通過ROC曲線下面積比較和敏感性比較各抗原的診斷效能，初步對各抗原的血清學(xué)診斷進(jìn)行評價。
　　 結(jié)果:

5、>　　 1.在為期45周的實(shí)驗(yàn)觀察期間，所有接種結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)的恒河猴精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)咳嗽和明顯消瘦等臨床癥狀，各臨床檢測指標(biāo)顯示，感染后前12周為感染早期，隨后進(jìn)入感染中期，本實(shí)驗(yàn)中所有猴均未進(jìn)入感染后期。感染早期，臨床上表現(xiàn)為外周血單核細(xì)胞一過性上升變化，外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)緩慢上升；感染第4周TST顯示陽性；第6周出現(xiàn)血清抗體；促炎癥細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-

6、6)出現(xiàn)一過性升高，抑炎癥因子(IL-4、IL-10)未出現(xiàn)特異性變化。感染中期，動物感染與免疫基本趨于平衡狀態(tài)，上述各項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)到感染前狀態(tài)，其中外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)上升，血清抗體維持較高水平，促炎因子TNF-α、IL-8開始激發(fā)產(chǎn)生。感染后第26和45周的組織病理學(xué)診斷顯示出典型的結(jié)核病變；組織載菌量檢測顯示，結(jié)核分枝桿菌主要存在于肺門淋巴結(jié)和肺組織中，其中1只猴(06-1523R)脾臟檢出病原。4

7、只感染猴的各項(xiàng)檢測指標(biāo)顯示出與人結(jié)核病感染相一致的潛伏感染特征。
　　 2.利用建立的模型，進(jìn)行不同結(jié)核菌素蛋白衍生物的篩選。結(jié)果顯示，4種結(jié)核菌素均可用于TST，敏感性和特異性差異不大，在直觀性上，哺乳類舊結(jié)核菌素注射部位顏色變化更明顯。高劑量組猴對連續(xù)TST產(chǎn)生持續(xù)強(qiáng)陽性反應(yīng)，低劑量組猴的TST反應(yīng)相對較弱，并出現(xiàn)間斷性陽性反應(yīng)，顯示免疫耐受；交替使用不同結(jié)核菌素可以提高TST的敏感性，但不能消除連續(xù)TST形成的耐受反應(yīng)。低

8、劑量組猴連續(xù)TST反應(yīng)強(qiáng)度的變化周期顯示，兩次TST最佳間隔時間不應(yīng)少于8周。對健康猴開展連續(xù)TST不會產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。
　　 3.利用建立的模型，進(jìn)行特異性抗原的診斷應(yīng)用研究。特異性抗體最早在感染的第4周產(chǎn)生，多數(shù)在感染的第6周產(chǎn)生；抗體最高水平出現(xiàn)在感染后的16～26周，其中10種抗原(Ag85b、CFP10、CFP10-ESAT-6、PPD-J、PPD-1、MPT64L、U1、38kDa、14kDa和TB16.3)可以

9、在所有猴體內(nèi)檢測到抗體。高劑量組猴對所有蛋白抗原產(chǎn)生抗體；低劑量組猴06-1411R和06-1445R均對2種抗原(ESAT-6和16kDa)不產(chǎn)生抗體。猴06-1445R對8種抗原(Ag85b、CFP10、CFP10-ESAT-6、PPD-J、MPT64L、U1、14kDa和TB16.3)出現(xiàn)抗體一過性升高。健康猴連續(xù)TST刺激不會產(chǎn)生特異性抗體。PPD-J和TB16.3在06-1519R感染前便出現(xiàn)較高水平的抗體；健康猴06-189

10、1R也對PPD-J產(chǎn)生了較高水平的抗體。
　　 4.各特異性抗原的臨床應(yīng)用評價。ROC曲線分析顯示，所有抗原的曲線下面積均大于0.7，其中6種抗原大于0.9。對各抗原的ROC曲線下面積和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行兩兩Z值檢驗(yàn)，CFP10與除Ag85b以外的其他抗原間存在顯著性差異，顯示出最高的診斷準(zhǔn)確性，Ag85b次之，與3種抗原間存在顯著性差異，而TB16.3顯示出最低的診斷準(zhǔn)確性，與所有抗原間都存在顯著性差異。在自然感染陽性猴檢出情況的配對

11、資料卡方檢驗(yàn)中，Ag85b與7種抗原間存在顯著性差異，顯示出較高的敏感性，其次是CFP10、CFP10-ESAT-6、ESAT-6、PPD-J、PPD、38kDa和MPT64L等7種抗原，而16kDa、U1、14kDa和TB16.3敏感性較低。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究利用H37Rv菌株成功感染恒河猴，表現(xiàn)潛伏性感染模型特征。
　　 2.所選4種結(jié)核菌素均可用于TST，敏感性無顯著差異；TST反應(yīng)呈感染/暴

12、露劑量依賴性，連續(xù)TST不會高劑量感染猴的DTH反應(yīng)，但會導(dǎo)致低劑量感染猴產(chǎn)生免疫耐受反應(yīng)，交替使用不同結(jié)核菌素可以提高TST的敏感性，但不能消除免疫耐受。
　　 3.抗體在感染過程中的消長與感染劑量、感染時間、感染狀態(tài)和動物的免疫狀態(tài)有關(guān)，其中抗體水平與感染劑量正相關(guān)。高頻次TST刺激健康恒河猴不會產(chǎn)生免疫抗體反應(yīng)，不影響血清學(xué)檢測。
　　 4.重組蛋白中，5種抗原(CFP10、CFP10-ESAT-6、U1、MPT6