MiR-375參與宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)的機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是女性第三大常見腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女健康。盡管宮頸癌篩查在不斷普及，但仍有大量未經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)的中晚期病例。中晚期宮頸癌預(yù)后不良，5年生存率僅30～60％。泰素及鉑類為主的化療是中晚期宮頸癌不可或缺的治療手段之一，但化療不敏感是導(dǎo)致治療失敗的最重要原因之一，迄今尚未找到有效的逆轉(zhuǎn)方法。闡明宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性的機(jī)制對(duì)拓展宮頸癌根治性治療手段，改善中晚期宮頸癌的預(yù)后意義重大。
　　 近年發(fā)現(xiàn)，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial

2、-mesenchymaltransitions，EMT)在腫瘤耐藥中起重要作用，而微小RNA(MicroRNAs，miRNA)參與了EMT的調(diào)控，揭示miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT的調(diào)控機(jī)制為破解腫瘤耐藥的難題開辟了一個(gè)全新的途徑。EMT指上皮細(xì)胞在一些因素的作用下，失去細(xì)胞極性，丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤、游走遷移能力，變成了具備間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞，其表型表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘著蛋白(E-cadherinProt

3、ein，E-cadherin)表達(dá)減少或缺失，間質(zhì)性標(biāo)志物波形蛋白(VimentinProtein，Vimentin)、纖維結(jié)合蛋白(FibronectinProtein，F(xiàn)ibronectin)、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherinProtein，N-cadherin)等表達(dá)升高。EMT是維系生命體組織平衡的基本生物事件，在個(gè)體發(fā)育和生長中起重要作用.研究證實(shí)，胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的耐藥細(xì)胞均發(fā)生EMT樣轉(zhuǎn)變；而具備間質(zhì)

4、細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞可獲得凋亡抵抗，進(jìn)而對(duì)化療耐藥。
　　 已知有多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子通過多種信號(hào)通路參與了EMT的調(diào)控，如Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)、Notch信號(hào)通路等。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA也參與了腫瘤細(xì)胞的EMT。miRNA可通過直接靶向EMT表型分子E-cadherin或通過對(duì)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路分子的調(diào)控而影響EMT發(fā)生。但迄今為止，miRNA

5、、EMT與腫瘤耐藥的相關(guān)性研究尚處于起步階段，尚未見miRNA、EMT與官頸癌耐藥的相關(guān)報(bào)道。
　　 本課題先利用miRNA芯片篩查差異表達(dá)的與宮頸癌泰素化療相關(guān)的miRNA，進(jìn)而從miRNA及其靶分子、信號(hào)通路和EMT的交匯點(diǎn)切入，在分子、細(xì)胞和組織標(biāo)本多個(gè)水平，從細(xì)胞形態(tài)、表型和功能，及基因調(diào)控、信號(hào)通路等多個(gè)角度，求證miRNA在介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞EMT和化療耐藥中的作用。旨在揭示宮頸癌化療耐藥的本質(zhì)并發(fā)現(xiàn)新的有效藥物靶點(diǎn)，為

6、改進(jìn)中晚期宮頸癌的現(xiàn)行治療模式提供科學(xué)證據(jù)。
　　 第一部分，宮頸癌泰素耐藥相關(guān)miRNAs的篩選和鑒定
　　 目的：
　　 篩選和鑒定宮頸癌泰素(Taxol)化療相關(guān)miRNAs。
　　 方法：
　　 利用LCSciences公司的μParaflo微流體芯片，分別比較5例泰素化療敏感與4例泰素化療耐藥的宮頸鱗癌患者化療前癌組織間miRNA表達(dá)譜的差異、4例宮頸鱗癌患者自身泰素化療前后配對(duì)的癌組織

7、間miRNA表達(dá)譜之間的差異，以差異倍數(shù)不低于2倍、芯片的信號(hào)值>500且P值<0.05的差異miRNAs作為陽性。對(duì)差異表達(dá)的miRNAs，從中選取表達(dá)上調(diào)的miR-375和miR-424及表達(dá)下調(diào)的miR-181b、miR-224和miR-27a，使用Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR法檢測(cè)泰素化療前后宮頸細(xì)胞株及組織間上述miRNAs表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.宮頸鱗癌泰素化療敏感

8、、耐藥組織間miRNA表達(dá)譜差異分析未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA。
　　 2.宮頸鱗癌患者自身化療前后配對(duì)的宮頸癌組織miRNA表達(dá)譜差異分析發(fā)現(xiàn)有13個(gè)miRNAs在化療后的宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)、而8個(gè)miRNAs在化療后的宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)。
　　 3.Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR法證實(shí)miR-375和miR-424在經(jīng)Taxol化療后的細(xì)胞組明顯上調(diào)(P<0.05)，miR-181b、mi

9、R-27a和miR-224在經(jīng)Taxol化療后的細(xì)胞中的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　 4.MiR-375在Taxol化療后的宮頸癌細(xì)胞和組織中，表達(dá)上調(diào)且呈劑量依賴性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.經(jīng)Taxol化療后，宮頸癌細(xì)胞和組織可發(fā)生miRNA表達(dá)譜的改變。
　　 2.Taxol化療可以上調(diào)宮頸癌細(xì)胞及組織中miR-375的表達(dá)，提示miR-375可能參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞對(duì)Tax

10、ol敏感性。
　　 第二部分，MiR-375參與調(diào)控官頸癌細(xì)胞對(duì)泰素敏感性的研究
　　 目的：
　　 明確miR-375在調(diào)節(jié)宮頸癌泰素(Taxol)化療敏感性中的作用。
　　 方法：
　　 通過慢病毒基因工程將Pre-miR-375及其相應(yīng)陰性對(duì)照的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)陽性細(xì)胞(表達(dá)EGFP)進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定高表達(dá)miR-375及其相應(yīng)陰性對(duì)

11、照的宮頸癌細(xì)胞；用MTS法檢測(cè)miR-375對(duì)Taxol的藥物敏感性(給藥的濃度梯度分別為0、5、10、20、50、100nM)的影響，以未轉(zhuǎn)染的及轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照序列的宮頸癌細(xì)胞作為對(duì)照，明確不同miR-375表達(dá)水平與宮頸癌Taxol化療敏感性的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過慢病毒基因工程構(gòu)建并篩選得到高表達(dá)miR-375的宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞，運(yùn)用stem-looprealtimeRT-P

12、CR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染control慢病毒對(duì)比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-375的宮頸癌細(xì)胞的miR-375水平顯著升高(P<0.00)。
　　 2.MiR-375穩(wěn)定高表達(dá)的宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞的IC50分別為45.81±1.33nM、20.56±1.72nM和20.18±0.72nM；而對(duì)照組的IC50分別為8.54±1.52nM、7.98±2.60nM和13.28±0.52nM；隨著miR-375的表達(dá)量升高，宮

13、頸癌細(xì)胞對(duì)Taxol的化療敏感性下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用慢病毒基因轉(zhuǎn)染的方法可建立穩(wěn)定表達(dá)miR-375的宮頸癌細(xì)胞模型。
　　 2.外源性上調(diào)miR-375后能降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)Taxol化療的敏感性。
　　 第三部分，MiR-375通過靶向E－cadherin表達(dá)參與EMT及宮頸癌細(xì)胞對(duì)泰素的敏感性
　　 目的：
　　 探討miR-375參與調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞對(duì)泰

14、素(Taxol)化療敏感性的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 首先通過Real-timeRT-PCR及Western-blot法檢測(cè)宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度Taxol化療前后E-cadherin及EMT相關(guān)分子的表達(dá)情況，并分析Taxol化療與EMT及miR-375表達(dá)水平的相關(guān)性；其次分別利用TGF-β、EGF-β誘導(dǎo)官頸癌細(xì)胞EMT，MTS檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，以探討EMT與宮頸癌細(xì)胞對(duì)Ta

15、xol耐藥、EMT與miR-375表達(dá)間的調(diào)控關(guān)系；最后在生物學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，通過熒光素酶報(bào)告基因、miR-375及E-cadherin的功能實(shí)驗(yàn)，揭示miR-375參與誘導(dǎo)的EMT及Taxol化療耐藥的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度Taxol化療后72小時(shí)E-cadherin、Vimentin在mRNA水平的表達(dá)與化療前相比無明顯差異(P>0.05)。
　　

16、 2.宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度Taxol化療后72小時(shí)E-cadherin、Vimentin、Fibronectin和N-cadherin的蛋白水平表達(dá)與化療前相比有明顯差異且呈Taxol劑量依賴性(P<0.05)。
　　 3.Taxol化療前后E-cadherin蛋白水平表達(dá)與miR-375的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[rs=0.345(Siha)，rs=-0.476(Caski)，P<0.05]。
　

17、　 4.Taxol可以誘導(dǎo)宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞發(fā)生EMT；宮頸癌細(xì)胞EMT后對(duì)Taxol的敏感性明顯下降，而對(duì)miR-375的表達(dá)無明顯影響。
　　 5.E-cadherin是miR375的直接靶體；miR-375可以通過靶向抑制E-cadherin參與Taxol誘導(dǎo)EMT，引起宮頸癌細(xì)胞對(duì)Taxol耐藥。
　　 結(jié)論：
　　 1.Ecadherin是宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子。