MiR-375靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp1在宮頸癌進(jìn)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是全球女性最常見的婦科惡性腫瘤之一。高危人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HR-HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的必要因素，已經(jīng)在99.7％的宮頸癌組織中證實(shí)HPVDNA的存在，其中HPV16、18是最為常見的高危類型。研究表明，HR-HPV表達(dá)的病毒癌基因E6和E7，可分別結(jié)合降解宿主細(xì)胞P53和Rb，并通過(guò)一系列分子事件，引起細(xì)胞周期、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為改變，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生與進(jìn)展。

2、
　　 miRNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子單鏈RNA，通過(guò)與靶基因mRNA(messengerRNA)序列的3’非翻譯區(qū)或編碼區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與了細(xì)胞凋亡、代謝、分化、激素分泌等生理過(guò)程。近年發(fā)現(xiàn)，miRNA也在腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過(guò)程發(fā)揮重要作用，并在病毒感染性疾病中與病毒的感染、清除、復(fù)制等過(guò)程密切相關(guān)。
　　 miR-375是一個(gè)研究較為廣泛的miRNA。在我們

3、以往的宮頸癌組織miRNA芯片研究中發(fā)現(xiàn)，miR-375在宮頸癌組織中與正常組織相比明顯下調(diào)。為了確定miR-375在宮頸癌進(jìn)展過(guò)程中的作用，本研究首先驗(yàn)證miR-375在宮頸癌和正常組織中的表達(dá)差異，并比較分析miR-375的表達(dá)水平與宮頸癌不良預(yù)后因素的相關(guān)性。再通過(guò)基因功能實(shí)驗(yàn)，探尋miR-375的異常表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的可能作用并確定其發(fā)揮作用的靶基因，以明確miR-375發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制。最后利用組織標(biāo)本和功能實(shí)驗(yàn)

4、，探討miR-375在宮頸癌中的表達(dá)失調(diào)與HR-HPV癌蛋白的相互關(guān)系。旨在尋找可用于宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)和治療靶點(diǎn)的miRNA，為探尋宮頸癌防治新策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第一部分，miR-375在宮頸癌中的表達(dá)及意義
　　 目的：
　　 驗(yàn)證miR-375在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，探討miR-375與宮頸癌不良預(yù)后因素之間的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 收集宮頸鱗癌組織和正常上皮組織標(biāo)本，采用Stem

5、-loopRT-PCR和RealtimePCR法檢測(cè)170例宮頸鱗癌組織和68例宮頸正常上皮組織的miR-375的表達(dá)水平，收集完整并整理病例的臨床病理資料，分析miR-375的表達(dá)水平與宮頸癌臨床不良預(yù)后因素的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.miR-375在宮頸鱗癌組織的表達(dá)水平與宮頸正常上皮組織相比顯著下調(diào)。
　　 2.miR-375表達(dá)與FIGO分期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤(rùn)、陰道壁累及以及脈管浸潤(rùn)有關(guān)

6、。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-375的表達(dá)水平在宮頸癌組織與正常組織相比顯著下調(diào)。
　　 2.miR-375低表達(dá)可能與宮頸癌預(yù)后不良因素相關(guān)，提示組織miR-375測(cè)定可能可以用于預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后。
　　 第二部分，miR-375靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp1在宮頸癌進(jìn)展中的機(jī)制研究
　　 目的：
　　 明確miR-375對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用，并確定miR-375發(fā)揮

7、功能的靶基因，以揭示miR-375參與宮頸癌進(jìn)展的作用及分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 在宮頸癌細(xì)胞株Siha和CaSki中，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)miR-375或siRNA干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp1的表達(dá)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并利用RealtimeRT-PCR和WesternBlot的方法檢測(cè)Sp1的mRNA和蛋白水平，最

8、后利用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法確認(rèn)miR-375與Sp1的靶向關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.在宮頸癌細(xì)胞株中，過(guò)表達(dá)miR-375可降低Siha和CaSki細(xì)胞的增殖能力，并阻滯細(xì)胞周期于G1期，使細(xì)胞的G1期細(xì)胞數(shù)明顯增加，S期細(xì)胞數(shù)下調(diào)，抑制細(xì)胞劃痕的愈合能力和細(xì)胞的侵襲功能。
　　 2.在宮頸癌組織中miR-375表達(dá)與Sp1mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-375可下調(diào)Sp1的mRNA水平和蛋白水平。

9、
　　 3.miR-375與含Sp13'UTR區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，可下調(diào)熒光素酶的活性，而不影響3'UTR區(qū)突變報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。
　　 4.在宮頸癌細(xì)胞中，干擾Sp1的表達(dá)可抑制Siha和CaSki細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G1期，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 結(jié)論：
　　 1.在宮頸癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-375可抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期于G1期、并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，提示mi

10、R-375表達(dá)下調(diào)參與了官頸癌的進(jìn)展過(guò)程。
　　 2.Sp1是miR-375的直接靶基因，miR-375通過(guò)靶向Sp1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　 第三部分，miR-375表達(dá)與病毒HPV16E6、E7相關(guān)性探討
　　 目的：
　　 確定細(xì)胞miR-375表達(dá)與HR-HPV感染及E6/E7表達(dá)的相關(guān)性，探索HPV病毒蛋白靶向調(diào)控宿主細(xì)胞miR-375表達(dá)和miR-375靶向調(diào)控病毒癌基因的作用。

11、r>　　 方法：
　　 采用Stem-loopRTPCR的方法檢測(cè)不同HR-HPV感染狀態(tài)的宮頸正常上皮組織中的miR-375的表達(dá)，利用用HPV16E6/E7表達(dá)質(zhì)粒在C33A細(xì)胞中表達(dá)E6/E7，利用siRNA技術(shù)干擾Siha細(xì)胞表達(dá)E6/E7，檢測(cè)不同E6/E7表達(dá)水平情況下miR-375的表達(dá)水平。同時(shí)在Siha細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-375，利用RealtimeRTPCR和WesternBlot法檢測(cè)病毒癌基因E6/E7的

12、表達(dá)及其下游分子P53、Rb、MCM7蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在HR-HPV感染和無(wú)感染的宮頸正常上皮組織中，miR-375的表達(dá)水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.HPV16E6/E7表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞或E6/E7siRNA干擾Siha細(xì)胞引起E6/E7表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，miR-375的表達(dá)水平均無(wú)顯著變化。
　　 3.單純HPV16感染的宮頸病變組織中，miR-375的表達(dá)與E6/E7

13、mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。
　　 4.在宮頸癌細(xì)胞株Siha中，過(guò)表達(dá)miR-375可下調(diào)E6/E7mRNA及E7和MCM7蛋白水平，并上調(diào)P53、pRB蛋白水平。
　　 5.在HCT-116細(xì)胞株中，過(guò)表達(dá)miR-375，P53、pRB和MCM7的蛋白水平無(wú)明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.在宮頸癌細(xì)胞中，上調(diào)miR-375表達(dá)可抑制E6/E7的表達(dá)，并影響其下游分子P53、Rb及MCM7的表達(dá)。