人鈣周期素結(jié)合蛋白（CacyBP）基因的克隆和功能研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文人鈣周期素結(jié)合蛋白（CacyBP）基因的克隆和功能研究姓名：劉衛(wèi)霞申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：袁建剛;強(qiáng)伯勤2002.6.1生里墊塑墨型查堂塑主塑窒蘭堡苧侶p 2 3 ( c o —c h a p e r o n ，一種類似H s p 2 0 的分子伴侶蛋白) 相似性達(dá)9 5 ％，并據(jù)此推測了C a c y B P 的三級結(jié)構(gòu)。為了得到鈣周期素結(jié)合蛋白的多克隆抗體，以

2、便于在組織和細(xì)胞水平對該蛋白進(jìn)行研究，將鈣周期素結(jié)合蛋白的編碼區(qū)克隆至原核表達(dá)載體p E T 2 8 c 上，用I P T G 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用目的蛋白質(zhì)N 端融合的6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽，用親和層析的方法進(jìn)行純化，得到純度很高的目的蛋白質(zhì)。用純化的鈣周期素結(jié)合蛋白每兩周一次免疫兔子，得到了高效價(jià)( 1 ：1 6 萬) 的多克隆抗體。為了研究鈣周期素結(jié)合蛋白的組織表達(dá)譜，從小鼠腦c D N A 文庫中擴(kuò)增出C a c y B P 編碼區(qū)核苷

3、酸序列，N o r t h e r n 雜交小鼠多組織膜，結(jié)果表明C a c y B P 在小鼠各個(gè)組織中都有表達(dá)。為了從蛋白水平觀察C a c y B P 的組織表達(dá)譜，用制備的兔抗人C a c y B P 抗血清檢測小鼠的8 種組織。發(fā)現(xiàn)C a c y B P 在小鼠各種組織中廣泛表達(dá)。只是在骨骼肌、肝、胃、胎盤、子宮中高表達(dá)，在腦、肺組織中中等量表達(dá)，在腎臟中沒有檢測到表達(dá)。為了分析鈣周期素與鈣周期素結(jié)合蛋白的相互作用，將純化后的

4、G S T —C a c y 融合蛋白與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系S H - S Y 5 Y 細(xì)胞總蛋白提取液共純化的結(jié)果表明鈣周期素結(jié)合蛋白能與G S T —C a c y 共純化，但用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證二者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用沒有得到陽性結(jié)果?？紤]到鈣周期素在體外能與鈣周期素結(jié)合蛋白結(jié)合，而鈣周期素與細(xì)胞周期有關(guān)，對鈣周期素結(jié)合蛋白與細(xì)胞周期的關(guān)系進(jìn)行了研究：采用T d R 雙阻斷的方法使人宮頸癌細(xì)胞系H e l a 細(xì)胞周期同步化于G 1