棉花Actin結(jié)合蛋白基因(GhVLN1)的克隆與功能分析.pdf

1、棉花是由胚珠表皮細(xì)胞經(jīng)過起始、伸長、次生加厚和成熟四個(gè)完全不同但又部分重疊的發(fā)育階段發(fā)育而成的單細(xì)胞纖維，在此過程中，纖維細(xì)胞伸長了1000～3000倍。細(xì)胞骨架的重排及其動(dòng)態(tài)變化為細(xì)胞的快速擴(kuò)張?zhí)峁┚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)支撐，運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)和進(jìn)行信號(hào)傳遞。因此，細(xì)胞骨架是棉花纖維發(fā)育重要分子機(jī)制之一。
　　 李氏無纖維(Ligon lintless-1:Li-1)是一種超短纖維突變體，纖維細(xì)胞過早退化并停止伸長，是研究棉花纖維伸長機(jī)制的理想材

2、料。本實(shí)驗(yàn)室曾以Li-1和其野生型的近等基因系TM-1(WT)為材料，分析了開花后4d、8d(DPA)纖維的蛋白質(zhì)組差異，鑒定了一個(gè)在Li-1纖維中下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)，因此，該蛋白質(zhì)可能與棉花纖維伸長有關(guān)。質(zhì)譜鑒定該蛋白質(zhì)為actin結(jié)合蛋白villin，與棉花EST(gi|109859616)編碼序列匹配度最高。以此為基礎(chǔ)，本文開展了以下研究并取得結(jié)果:
　　 1、根據(jù)該EST序列，通過RACE技術(shù)從棉花中克隆了一個(gè)編碼Acti

3、n結(jié)合蛋白Villin基因，暫定名為GhVLN1。其開放閱讀框?yàn)?886 bp，編碼961個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為23.72kDa，理論等電點(diǎn)為4.87.Blast結(jié)果顯示GhVLN1與植物villin基因有很高的同源性。
　　 2、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)GhVLN1基因進(jìn)行表達(dá)特征分析，結(jié)果顯示:該基因在根、莖、纖維中優(yōu)勢表達(dá)，在開花后6天的Li-1纖維中的表達(dá)量明顯低于TM-1，暗示GhVLN1的低豐度表達(dá)可能與Li

4、-1纖維細(xì)胞的不伸長有關(guān)。
　　 3、亞細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn)，GhVLN1定位在纖維狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上，基因功能預(yù)測該基因是與細(xì)胞骨架相關(guān)的villin基因，結(jié)果顯示GhVLN1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，與預(yù)測結(jié)果一致。
　　 4、構(gòu)建了pREP-5N-GhVLN1重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明，GhVLN1的導(dǎo)入后酵母菌體顯著變長，長/寬比顯著變大，推測該基因的表達(dá)影響了酵母的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞

5、縱向伸長。
　　 5、以野生型擬南芥為對(duì)照，觀察了擬南芥AtVLN1、AtVLN2、AtVLN3、AtVLN4、AtVLN5五種單基因突變體幼苗的表型特征，發(fā)現(xiàn)AtVLN3和AtVLN5突變體的葉心變黃，毛狀體和根毛數(shù)量明顯減少，幼苗長勢變?nèi)?。說明villin蛋白的失活在一定程度上會(huì)導(dǎo)致葉綠素不能正常合成，減少了毛狀體和根毛起始位點(diǎn)的數(shù)量，影響幼苗的正常生長。但不是所有villin基因的突變都會(huì)改變幼苗的表型，villin基因之