稻縱卷葉螟信息素結(jié)合蛋白基因的克隆與分析.pdf

1、靈敏的嗅覺在昆蟲的寄主定位、覓食、尋找庇護(hù)所、求偶、產(chǎn)卵以及躲避天敵和其它危險(xiǎn)等過程中起著重要的功能。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)是一種水稻上重要的遷飛性害蟲，其幼蟲具有卷苞危害的習(xí)性，化學(xué)防治成本較高，且易對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。有研究表明，稻縱卷葉螟雌蛾以釋放的性信息素混合物來吸引遠(yuǎn)距離的雄蛾，雄蛾對(duì)此物質(zhì)表現(xiàn)出極其的敏感性和選擇性，但目前關(guān)于稻縱卷葉螟嗅覺感受的分子機(jī)制并不清楚。因此，本課題以

2、稻縱卷葉螟為研究對(duì)象，在對(duì)其信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins，PBPs)基因克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)PBPs基因的表達(dá)模式及與氣味分子的結(jié)合特性進(jìn)行了分析，以期為明確稻縱卷葉螟嗅覺感受機(jī)制以及進(jìn)一步開發(fā)高效誘劑提供理論基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴稻縱卷葉螟信息素結(jié)合蛋白基因的克隆和序列分析。利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到了稻縱卷葉螟3個(gè)PBPs基因全長(zhǎng)，CmedPBP2、CmedP

3、BP3和CmedPBP4（GenBank登錄號(hào)分別為KC507181、KC507184和KC507185），其開放閱讀框全長(zhǎng)分別為495bp、549bp和444bp，編碼164、182和147個(gè)氨基酸。CmedPBP2和CmedPBP3預(yù)測(cè)N-末端分別包含21和22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，而CmedPBP4沒有信號(hào)肽。這3個(gè)基因編碼的氨基酸序列和其它鱗翅目螟蛾科昆蟲PBPs比對(duì)同源性較高(46.13％)，但是這三者之間的同源性較低，只

4、有22.76％，說明它們屬于不同的PBPs亞群。
　　 ⑵稻縱卷葉螟信息素結(jié)合蛋白基因的時(shí)空表達(dá)譜研究。熒光定量PCR結(jié)果表明，CmedPBPs基因在蛹期表達(dá)量很低，主要表達(dá)于成蟲的觸角，其余各部位（頭（無觸角）、胸、腹、足、翅）的表達(dá)量均很低。3個(gè)基因在雄蛾觸角中的表達(dá)量較高，尤其是CmedPBP2，高表達(dá)于雄蛾觸角（0d時(shí)雄蛾觸角的表達(dá)量大約是雌蛾的95倍）。這3個(gè)基因在不同日齡雄蛾觸角中的表達(dá)量均為0d和3d較高，1d較低

5、(P＜0.05)。在雌蛾觸角中的表達(dá)量也受日齡的影響，CmedPBP2、CmedPBP3和CmedPBP4分別在1d、0d和5d達(dá)到最大值，然而雌蛾交配與否對(duì)這3個(gè)基因的表達(dá)量均無影響。
　　 ⑶稻縱卷葉螟信息素結(jié)合蛋白的原核表達(dá)、蛋白純化及熒光結(jié)合特性分析。利用基因重組的方法將這3個(gè)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、pET-28a(+)和pET-22b(+)中，其中只有pET-22b(+)-CmedPBP4在大腸桿菌B

6、L21(DE3)plysS中成功表達(dá)，并且主要以包涵體形式存在。通過包涵體變性和復(fù)性，經(jīng)DE52陰離子交換柱一步法純化得到純度較高的重組蛋白。
　　 ⑷利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)研究CmedPBP4與32種水稻揮發(fā)物的結(jié)合特性，以1-NPN為探針，篩選出了10種與CmedPBP4有結(jié)合能力的氣味物質(zhì)，結(jié)合能力由強(qiáng)到弱依次是:(-)-反式石竹烯、(Z)-法尼烯、（-）-α-雪松烯、α-蒎烯、紫羅蘭酮、香葉烯、柏木腦（解離常數(shù)均在20以內(nèi)