嚴(yán)重?zé)齻鹦墓δ苷系K的心電紊亂和鈣信號異常機(jī)制.pdf

1、本文應(yīng)用膜片鉗和激光共聚焦顯微成像技術(shù)對嚴(yán)重?zé)齻孕菘舜笫笮氖壹〖?xì)胞電生理活動以及鈣信號的變化及其機(jī)制進(jìn)行研究。 第一部分嚴(yán)重?zé)齻鹦募〖?xì)胞動作電位時(shí)程延長 嚴(yán)重?zé)齻餛T間期離散，它具有潛在引發(fā)心律失常的威脅。同時(shí)在單個(gè)心肌細(xì)胞由于動作電位時(shí)程(action potential duration，APD)的延長影響Ca<'2+>內(nèi)流，從而改變興奮．收縮偶聯(lián)時(shí)鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)而影響心臟的舒縮功能，但其機(jī)制尚不十分清楚。本研究

2、復(fù)制大鼠～40％體表面積(total body surface area，TBSA)Ⅲ度燒傷模型，燒傷后按照4 ml/kg/1％TBSA腹腔補(bǔ)液。在傷后12 h大鼠心功能明顯減弱時(shí)分離其心肌細(xì)胞，采用膜片鉗技術(shù)直接研究心肌細(xì)胞APD以及AP復(fù)極化相關(guān)的重要離子通道，包括瞬間外向鉀電流(transient outward current，I<,to>)，L-型鈣電流(L-type Ca<'2+> current，I<,ca-L>)和內(nèi)向整

3、流鉀電流(inward rectitier K<'+>current，I<,K1>)的改變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1．1 嚴(yán)重?zé)齻饎幼麟娢粫r(shí)程延長燒傷后12 h單個(gè)心肌細(xì)胞APD明顯延長，APD<,50>和APD<,90>在燒傷組分別為21.16±1.59 ms，108.52±10.39 ms(n=22)，明顯長于對照組的7.58±0.48 ms，55.78±3.09 ms(n=17,P<0.000)。 1．2 嚴(yán)重

4、燒傷引起I<,to>電流密度降低把細(xì)胞鉗制在-80 mV，給予細(xì)胞250 ms、從-50 mV開始以10 mV遞增到+60mV的電壓刺激。燒傷組I<,to>電流密度在-30～+60 mV的電壓范圍內(nèi)均明顯低于對照組。在+60mV電壓下燒傷組的電流密度(20.39+1.98 pA/pF，n=12)明顯低于對照組(34.02±3.77 pA/pF，n=19，P<0.01)； 1．3 嚴(yán)重?zé)齻抡{(diào)I<,K1>功能把細(xì)胞鉗制于-80 m

5、V，給予500 ms，從0 mV至-120 mV，以10 mV遞減的電壓刺激，測定每一電壓刺激下穩(wěn)定狀態(tài)電流為I<,K1>電流。燒傷組的I<,K1>在-120至-90 mV電壓刺激下所產(chǎn)生的內(nèi)向電流顯著低于對照組。 1．4 嚴(yán)重?zé)齻桓淖僆<,L-Ca>流大小細(xì)胞鉗制在-40 mV，給予300 ms，從-30 mV開始以10 mV遞增至+60 mV的刺激，記錄不同電壓下的內(nèi)向電流，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I<,Ca-L>在兩組之間無明顯差異。

6、 結(jié)論：嚴(yán)重?zé)齻餓<,to>和I<,K1>功能下降調(diào)節(jié)，是導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞動作電位時(shí)程的延長的重要原因。 第二部分嚴(yán)重?zé)齻鹦募〖?xì)胞鈣信號異常 燒傷引起心功能障礙是臨床和實(shí)驗(yàn)觀察證明的事實(shí)，但引起心功能障礙的細(xì)胞和分子機(jī)制并不完全清楚。以往研究表明，燒傷引起心功能障礙與細(xì)胞內(nèi)鈣信號紊亂有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠40％體表面積燒傷模型，燒傷12h心功能明顯下降時(shí)急性分離心肌細(xì)胞，結(jié)合膜片鉗和共聚焦顯微成像技

7、術(shù)對細(xì)胞內(nèi)鈣信號進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)： 2．1嚴(yán)重?zé)齻鹦募∈湛s力、鈣瞬變水平下降 用場刺激(10V、1Hz)引起心肌細(xì)胞收縮。燒傷心肌細(xì)胞平均最大收縮幅度明顯下降，由對照組的10.51±0.39％(n=123)下降到燒傷組的5.75±0.18％(n=159，P<0.000)。動作電位(AP)引起的鈣瞬變水平也呈現(xiàn)明顯的下降，鈣瞬變的峰值(△F/F<,0>)從對照組的4.01±0.08(n=123)下降到燒傷組的3.04±0

8、.07(n=159，P<0.00)。這和平均收縮幅度明顯下降具有一致性。 2．2嚴(yán)重?zé)齻档团d奮收縮偶聯(lián)效率 多種因素決定AP-鈣瞬變，包括觸發(fā)信號L型鈣電流和SR釋放。因此我們同時(shí)記錄細(xì)胞膜去極化引起的鈣電流和鈣瞬變，并分析興奮-收縮偶聯(lián)效率以確定引起收縮期鈣瞬變的原因。結(jié)果表明，在-20 mV到+40 mV電壓之間鈣瞬變的峰值在燒傷組明顯下降，而鈣電流密度沒有發(fā)生明顯變化。燒傷組心肌細(xì)胞興奮一收縮偶聯(lián)效率在-20 m

9、v到+40 mV電壓范圍內(nèi)顯著降低。結(jié)果表明，SR鈣釋放而非鈣電流的改變導(dǎo)致了燒傷時(shí)AP-鈣瞬變的降低 2．3嚴(yán)重?zé)齻鸺{網(wǎng)鈣部份耗竭 肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的大小很大程度上決定了細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的水平，因此我們進(jìn)一步探察燒傷對心肌細(xì)胞鈣庫容量的影響。高濃度Caffeine使雷諾丁受體(Ryanodines，RyRs)處于完全開放狀態(tài)，致使SR內(nèi)鈣完全排空，因此caffeine引起的鈣瞬態(tài)反映了SR鈣庫水平。結(jié)果顯示，caffe

10、ine引起的鈣瞬變峰值由對照組的4.71±0.09(n=153)下降到了燒傷組的3.67±0.07(n=256)，P<0.000。提示在燒傷大鼠的心肌細(xì)胞中，興奮-收縮偶聯(lián)過程中的CICR(calcium induced calciumrelease)的功能下調(diào)主要是由于肌漿網(wǎng)中鈣容量的部份耗竭所致。 2．4嚴(yán)重?zé)齻餜yRs反應(yīng)性增強(qiáng) 鈣火花是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))上單個(gè)鈣釋放單元中幾個(gè)鈣釋放通道RyRs的隨機(jī)性開放。鈣火

11、花的發(fā)現(xiàn)使我們能夠在完整細(xì)胞研究RyRs的功能。因此，我們對來自132個(gè)對照組的細(xì)胞中的299個(gè)鈣火花以及來自168個(gè)燒傷心肌細(xì)胞中的926個(gè)鈣火花作了分析和比較，發(fā)現(xiàn)在燒傷組的心肌細(xì)胞中，鈣火花的發(fā)放頻率明顯高于對照組，而且鈣火花的峰值(F/F<,0>)有所下降。發(fā)放頻率由對照組的1.05±0.06/100 μm.s升高到2.49±0.14/100μms，P<0.000發(fā)放頻率大約為對照組的將近3倍之多。而鈣火花的峰值則由2.32±0

12、.03降低到燒傷組的2.09±0.09，P<0.000。但是鈣火花的上升速度及下降速度則沒有明顯的變化。結(jié)果表明燒傷使RyRs的反應(yīng)性異常升高。 2．5嚴(yán)重?zé)齻鸺?xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定性下降 我們把進(jìn)一步測定了高鈣(10 mM)灌流液刺激對RyRs的功能的影響。結(jié)果顯示，在燒傷組的細(xì)胞中，鈣波更容易被激發(fā)，燒傷組的發(fā)生頻率為1.17±0.07/100μms(n=131)，而對照組的鈣波發(fā)生頻率只有0.40±0.03/100μms

13、，n=109，P<0.000)。而且，燒傷組的發(fā)生的鈣波很多時(shí)候出現(xiàn)斷裂、扭曲的現(xiàn)象，連續(xù)性相對較差，傳播的速度和距離都有所下降，不能夠很好地完成鈣信號的傳播。同時(shí)在同一位點(diǎn)觀察到重復(fù)發(fā)放鈣波，提示RyRs功能已受到了嚴(yán)重的損傷。2．6抗氧化治療保護(hù)燒傷引起的心功能及糾正鈣紊亂Vitamin C和Vitamin E聯(lián)合抗氧化治療使燒傷大鼠心肌細(xì)胞鈣火花發(fā)放趨于正常。燒傷+抗氧化治療組大鼠心肌細(xì)胞的鈣火花幅度(F/F<,0>)為2.44±

14、0.03，n=422，顯著高于燒傷組(2.09±0.01，n=926)，P<0.000。尤為重要的是，抗氧化治療使燒傷引起的鈣火花發(fā)放頻率增加的幅度顯著降低。由治療前的2.49±0.14/100μm.s下降到治療后1.21±0.06/100 μm.s，P<0.000。 隨著鈣火花活動的恢復(fù)，抗氧化治療使SR鈣庫容量得以恢復(fù)。燒傷+抗氧化治療組，20 mm caffeine誘導(dǎo)的鈣瞬變的幅度是5.40±0.14(n=47)，與抗氧

15、化治療組(5.45±0.21，n=34)無明顯的差別，但明顯高于燒傷組(3.67±0.07,n=256)。AP-鈣瞬變與SR鈣庫的改變呈一致性改變，即抗氧化治療使AP-鈣瞬變有所恢復(fù)。盡管燒傷+抗氧化治療組心肌細(xì)胞的鈣瞬變△F/F0(4.96±0.15，n=68)與抗氧化治療組(5.36±0.17，n=62)相比，有輕微下降，但仍明顯高于燒傷組(3.04±0.06m,n=159,P<0.01)。 隨著細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂的糾正，燒傷大鼠

16、心功能得到明顯改善，表現(xiàn)為燒傷12h后心功能指標(biāo)INSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax由燒傷組的56.09±7.07 mmHg，+1338±340 mmHg/sec，-1036±173 mmHg/sec，上升到治療組的95.7±9.1 mmHg，+3543+383mmHg/sec，-3543±296 mmHg/sec，(P<0.01)。 結(jié)論： 1．燒傷引起大鼠的心肌細(xì)胞AP-鈣瞬態(tài)幅度(△F/F<,0>)減小

17、，它是引起心肌細(xì)胞收縮力下降的重要原因。 2．燒傷時(shí)E-C效率明顯下降引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放減少，是燒傷所致心肌細(xì)胞鈣瞬變大幅下降的重要機(jī)制。3．燒傷引起心肌細(xì)胞SR鈣庫容量發(fā)生部分耗竭，導(dǎo)致了E-C效率的降低。 4．燒傷后心肌細(xì)胞RyR活動增加(鈣火花發(fā)放增加)，SR鈣漏流增強(qiáng)，是SR鈣庫容量部分耗竭，胞漿鈣蓄積的重要原因，它是燒傷心功能障礙發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 5．引起RyR反應(yīng)性升高的重要機(jī)制是燒傷引起的氧化應(yīng)激