燒傷延遲復(fù)蘇后免疫功能障礙早期識(shí)別和防治的研究.pdf

1、目的： 1.探討燒傷延遲復(fù)蘇時(shí)CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率和外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的變化及其與膿毒癥和炎癥介質(zhì)的關(guān)系。 2.探討胸腺肽α1和卡巴膽堿對(duì)脂多糖刺激后人血CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率及淋巴細(xì)胞凋亡率的影響。 3.探討卡巴膽堿對(duì)脂多糖刺激引起人血單核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的影響及其受體機(jī)制。 方法： 1.50例燒傷面積大于30％的燒傷患者，按傷后是否及時(shí)有效復(fù)蘇分為延遲復(fù)蘇組和非

2、延遲復(fù)蘇組，于傷后1、3、7、14、28 d取外周血，延遲復(fù)蘇組患者住院期間發(fā)生膿毒癥后連續(xù)兩天取外周血。20例健康體檢者外周血作為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率和外周血淋巴細(xì)胞凋亡率，ELISA法測(cè)定血漿中TNF-α和IL-10的含量。 2.分離、培養(yǎng)正常人外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，對(duì)照組僅加1640培養(yǎng)液，脂多糖(LPS)組加LPS刺激，LPS+卡巴膽堿組先用不同濃度卡巴膽堿(100、10、1、0.

3、1、0.01μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后，再加入LPS(100ng/mL)刺激，LPS+胸腺肽α1組先用不同濃度胸腺肽α1(100、10、1、0.1、0.01μg/mL)預(yù)處理細(xì)胞后，再加入LPS(100ng/mL)刺激，培養(yǎng)12h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率和外周血淋巴細(xì)胞凋亡率。 3.取6例正常獻(xiàn)血員外周血，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，再利用單核細(xì)胞的貼壁性，分離獲得單核細(xì)胞。用含10％胎牛血清的1

4、640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，加入包被了特異性捕獲抗體的96孔板。實(shí)驗(yàn)分為6組：①空白對(duì)照組(C組)：85μl細(xì)胞+15μl1640；②LPS單獨(dú)刺激組(L組)：85μl細(xì)胞+5μl LPS+10μl1640；③卡巴膽堿預(yù)處理組(K組)：85μl細(xì)胞+5μl卡巴膽堿+5μl LPS+5μl1640；④阿托品+卡巴膽堿預(yù)處理組(A+K組)：85μl細(xì)胞+5μl阿托品+5μl卡巴膽堿+5μl LPS；⑤α-Bgt+卡巴膽

5、堿組預(yù)處理組(α-Bgt+K組)：85μl細(xì)胞+5μlα-Bgt+5μl卡巴膽堿+5μl LPS；⑥煙堿預(yù)處理組(N組)：85μl細(xì)胞+5μl煙堿+5μl LPS+5μl1640。K組和N組的處理過程為加入卡巴膽堿或煙堿5μl，室溫下靜置5min；加入LPS5μl。A+K組和α-Bgt+K組則在加入卡巴膽堿前5min加入阿托品或僅α-Bgt5μL；L組僅加LPS和1640培養(yǎng)液，C組僅加1640培養(yǎng)液。在整個(gè)反應(yīng)體系中各試劑終濃度分別為

6、LPS0.1μg/ml，卡巴膽堿和煙堿100gmol/L，阿托品1mmol/L，α-Bgt2μg/ml，K組預(yù)先用100、10、1、0.1，0.01μmol/L五個(gè)濃度組進(jìn)行試驗(yàn)并采用最佳濃度100μmol/L進(jìn)行機(jī)制探討研究。所采用濃度參照文獻(xiàn)[1]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)TNF-α和IL-6時(shí)，細(xì)胞在37℃、5％CO2及95％空氣、飽和濕度的CO2孵箱孵育12h，檢測(cè)IL-10時(shí)孵育20h。洗去細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的TNF-α、IL-6、

7、IL-10檢測(cè)抗體，經(jīng)鏈酶親和素藕聯(lián)的辣根過氧化物酶催化底物顯色后，效應(yīng)細(xì)胞即單核細(xì)胞所在位置會(huì)留下約10-20μm大小的斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞，斑點(diǎn)的大小可以反應(yīng)每個(gè)細(xì)胞釋放介質(zhì)的多少。通過斑點(diǎn)計(jì)數(shù)可以確定分泌TNF-α、IL-6、IL-10的細(xì)胞數(shù)，寬點(diǎn)，總密度是斑點(diǎn)總面積占整個(gè)孔底面積的百分比，表示細(xì)胞因子的濃度。處理完畢后經(jīng)全自動(dòng)免疫斑點(diǎn)圖像分析儀分析檢測(cè)。 結(jié)果： 1.燒傷患者外周血CD14+單核細(xì)胞HL

8、A-DR表達(dá)率明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)，延遲復(fù)蘇患者明顯低于非延遲復(fù)蘇患者(P＜0.01或P＜0.05)，發(fā)生膿毒癥時(shí)CD14+單核細(xì)胞HLA-DR.表達(dá)率基本都在10％以下，明顯低于健康體檢者及非膿毒癥患者傷后1、7、14、28 d(P＜0.01)。燒傷患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡率明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，延遲復(fù)蘇患者明顯高于非延遲復(fù)蘇患者，差異在傷后3d和28d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，膿毒癥發(fā)生后外周血淋巴細(xì)胞

9、凋亡率基本都在15％以上，明顯高于健康體檢者及非膿毒癥患者傷后各天(P＜0.01)。延遲復(fù)蘇組TNF-α檢出率高于非延遲復(fù)蘇組及對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，檢出樣本中TNF-α含量亦高于非延遲復(fù)蘇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。延遲復(fù)蘇組膿毒癥發(fā)生時(shí)TNF-α檢出率和檢出樣本中的TNF-α含量均高于非膿毒癥組血液標(biāo)本和正常對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。外周血CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率與IL-10水平呈負(fù)相關(guān)，在傷后

10、1、7、28天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 2.LPS單獨(dú)刺激單核細(xì)胞時(shí)，其HLA-DR表達(dá)率明顯降低，用卡巴膽堿或胸腺肽α1預(yù)處理后，HLA-DR表達(dá)率隨著卡巴膽堿或胸腺肽α1濃度的增高而增高。LPS單獨(dú)刺激淋巴細(xì)胞時(shí)，淋巴細(xì)胞凋亡率明顯增加，而用卡巴膽堿或胸腺肽α1預(yù)處理后，淋巴細(xì)胞凋亡率隨著卡巴膽堿和胸腺肽α1濃度的增高而降低。 3.LPS單獨(dú)刺激單核細(xì)胞時(shí)，TNF-α、IL-6、IL-10含量較對(duì)照組明顯升高(

11、P＜0.01)。用卡巴膽堿或煙堿預(yù)處理細(xì)胞后，TNF-α、IL-6含量明顯下降，與LPS單獨(dú)刺激組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但I(xiàn)L-10含量則無明顯變化?？ò湍憠A在0.01-100μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著卡巴膽堿濃度的增加，其對(duì)LPS刺激下單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的抑制作用也越明顯。阿托品預(yù)處理細(xì)胞后，卡巴膽堿對(duì)LPS刺激下單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6的抑制作用無明顯變化，而α-銀環(huán)蛇毒素預(yù)處理細(xì)胞后，卡巴膽堿

12、對(duì)TNF-α、IL-6的抑制作用明顯減弱。 結(jié)論： 1.燒傷延遲復(fù)蘇患者免疫功能低下，膿毒癥患者則更為嚴(yán)重。外周血CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率和淋巴細(xì)胞凋亡率可以作為動(dòng)態(tài)檢測(cè)患者的免疫功能狀態(tài)的有效指標(biāo)，CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率低于10％，外周血淋巴細(xì)胞凋亡率高于15％對(duì)膿毒癥的發(fā)生具有預(yù)警意義。 2.燒傷延遲復(fù)蘇患者體內(nèi)炎癥介質(zhì)釋放增加，抑炎介質(zhì)IL-10對(duì)HLA-DR的表達(dá)具有抑制作用。