恒定磁場對大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響及作用MG63細(xì)胞驗證無鎳不銹鋼生物相容性的研究.pdf

1、目的：實驗第一部分:首先利用稀土磁鐵釹鐵硼在實驗室條件下構(gòu)建一個恒定磁場,采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的骨髓來源基質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過表面標(biāo)志檢測后,傳代擴(kuò)增,將一部分基質(zhì)干細(xì)胞接種于直徑3.5cm培養(yǎng)皿中,然后將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為兩組,第一組采用藥物來誘導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞成骨的方法,即使用成骨條件培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入0.1uM的地塞米松,10Mmβ-磷酸甘油鈉,0.2mM的維生素C)。將大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成

2、骨細(xì)胞誘導(dǎo)。另外一組首先加入與第一組相同的藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,之后將培養(yǎng)皿放在細(xì)胞培養(yǎng)箱的稀土磁鐵釹鐵硼上,每天放置12小時使其在恒定磁場下暴磁,之后將其放入另外的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組細(xì)胞分別連續(xù)培養(yǎng)7天,在1、3、5、7天分別取出兩組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察,用MTr法進(jìn)行細(xì)胞增值檢測,堿性磷酸酶表達(dá)水平檢測,細(xì)胞VonKossa染色,第七天進(jìn)行細(xì)胞爬片的掃描電鏡觀察。比較兩組細(xì)胞成骨能力的不同,進(jìn)而評價恒定磁場在大鼠基質(zhì)干細(xì)胞體外

3、成骨誘導(dǎo)中的作用。同時,將另外一部分基質(zhì)干細(xì)胞接種與金屬鈦表面,將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的鈦片放入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中,同樣分為兩組,一組加入藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,另外一組在加入藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基的同時按照同樣方法進(jìn)行周期性的磁場刺激。在接種基質(zhì)干細(xì)胞24h后,檢測兩組鈦片表面的細(xì)胞粘附率,在連續(xù)培養(yǎng)7天后,對兩組鈦片表面進(jìn)行堿性磷酸酶染色和掃描電鏡觀察,比較兩組細(xì)胞成骨趨勢的不同,進(jìn)而評價恒定磁場對于鈦表面生長的基質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用的影響

4、。實驗的第二部分是使用MG63細(xì)胞系來檢測新型生物材料無鎳不銹鋼的生物相容性。首先培養(yǎng)擴(kuò)增MG63細(xì)胞,之后將MG63細(xì)胞分別接種于無鎳不銹鋼,317L,CoCrMo合金的表面,置于6孔板中,培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在開始培養(yǎng)12小時后檢測三種金屬表面的細(xì)胞粘附率,在培養(yǎng)的1,3,5天進(jìn)行MTT檢測,堿性磷酸酶檢測,金相顯微鏡觀察,比較三中金屬生物相容性的不同。
　　 方法：實驗一所需要的恒定磁場由稀土磁鐵釹鐵

5、硼產(chǎn)生,首先與中國科學(xué)院金屬研究所合作測定實驗所用的稀土磁鐵釹鐵硼的磁場強(qiáng)度,將稀土磁鐵釹鐵硼用75％的乙醇浸泡20min.風(fēng)干后于紫外線照射30min.保持無菌狀態(tài)移入細(xì)胞培養(yǎng)箱,過夜后備用。由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的四周齡SD大鼠(雌雄不限),脫頸處死后浸泡于75％的酒精中30min。無菌取出大鼠的雙側(cè)股骨,盡量去除軟組織,用無菌剪刀剪除兩端,用含10％胎牛血清的DMEM沖洗骨髓腔,所得的液體經(jīng)過200目篩網(wǎng),收集液體接種于2

6、5cm2培養(yǎng)瓶中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,5％CO2、37℃,24小時后換液,首次換液禁用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,輕輕倒出原培養(yǎng)基,小心注入新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡觀察,當(dāng)細(xì)胞接近與75％相互接觸時,進(jìn)行細(xì)胞傳代。一般4-5天傳代,傳代比例為1:3,取前兩代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原檢測,對基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到所需數(shù)量時,即可著手準(zhǔn)備對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和相關(guān)檢測了。首先將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒掉,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,加入2.5％的胰蛋白酶5ml消

7、化5min(此過程在光鏡監(jiān)視下完成),輕輕倒掉胰蛋白酶,加入2ml培養(yǎng)基反復(fù)吹打,收集液體于離心管中,1000r/min離心5min.棄去上清,2ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)板細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml,接種于3.5cm培養(yǎng)皿2ml。1天后換液,3天后再次換液,5天后光鏡下檢查培養(yǎng)皿,選擇細(xì)胞生長均勻,形態(tài)良好,無大片空白區(qū)或重疊生長的培養(yǎng)皿為本實驗選材。將經(jīng)過篩選的培養(yǎng)皿隨機(jī)分為兩組,,第一組采用藥物的基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨

8、方法,即在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入0.1uM的地塞米松,10mMβ-磷酸甘油鈉,0.2mM的維生素C.將大鼠的基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)。另外一組首先加入與第一組相同的藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,之后將培養(yǎng)皿放在細(xì)胞培養(yǎng)箱的稀土磁鐵釹鐵硼上,每天放置12小時,之后將其放入另外的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組細(xì)胞分別培養(yǎng)7天,在1、3、5、7天分別取出兩組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察并且照相,在相同的時間點(diǎn)上,將兩組細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/

9、ml,并接種在96孔板中,每孔加20ul的MTT,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時取出,吸除培養(yǎng)基后每孔加150ul的二甲基亞砜10分鐘后充分震蕩,置酶標(biāo)儀上選擇490nm波長測0D值。每次實驗重復(fù)五次。同樣在相同時間點(diǎn)上,從兩組中取出培養(yǎng)皿,用PBS輕輕沖洗3遍,在4℃環(huán)境下用0.01％TritonX-100裂解細(xì)胞12h,然后用吸管反復(fù)吹打1min,使細(xì)胞充分碎解。以14000r/min離心5min,吸取一部分上清液并用對一硝基苯磷酸鹽

10、(即PNPP)法檢測ALP(試劑盒),另一部分上清液用考馬斯亮蘭法測定總蛋白含量。堿性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏單位表示,結(jié)果以五次獨(dú)立實驗的平均值表示。對于VonKossa染色,將在測試時間點(diǎn)上的培養(yǎng)皿用含10％甲醛的PBS固定10min.之后用水清洗干凈,加入2％的硝酸銀溶液,在紫外線下孵育1h,之后用3％的硫代硫酸鈉中和5min,倒置顯微鏡下觀察照相。成骨能力旺盛的細(xì)胞會被銀原子染成黑色。在誘導(dǎo)的第7天,取出兩組中的蓋玻片進(jìn)

11、行掃描電鏡觀察。具體方法為:事先將無菌的蓋玻片放入培養(yǎng)皿中,將1.5ml的密度為1×104/ml的基質(zhì)干細(xì)胞滴在蓋玻片上,依靠表面張力使液體不外流。按照實驗條件分為兩組。連續(xù)誘導(dǎo)7天,在第7天時取出蓋玻片,置于2.5VOL％戊二醛固定液于4℃度冰箱中固定(最短兩小時)。吸去戊二醛固定液,加入蒸餾水清洗,隨后分別用50、75、95、100vol％的乙醇水溶液進(jìn)行系列脫水各十分鐘。將樣品取出后放入玻璃培養(yǎng)皿中。4℃冰箱中干燥12小時或過夜干

12、燥。采用掃描電子顯微鏡(SEM)對基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)等進(jìn)行觀察和分析并比較。另外取大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,接種于直徑為1cm的金屬鈦片上,將鈦片置于直徑為3.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的鈦片隨機(jī)分為兩組,一組加入藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)基,另外一組除加入藥物培養(yǎng)基外,同時按照以上的方法進(jìn)行磁場周期性刺激,兩組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7天,在最初的24小時后,分別取兩組鈦片進(jìn)行細(xì)胞粘附率檢測,7天后分別對兩組細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色和掃描電鏡觀察,堿性磷酸

13、酶染色采用試劑盒法,隨機(jī)選取5個視野,計算染色細(xì)胞占總細(xì)胞的比例,計算比較。,掃描電鏡采用以上方法進(jìn)行樣本制備。比較兩組細(xì)胞形態(tài)的不同。實驗的第二部分:關(guān)于無鎳不銹鋼的生物相容性的研究,采取以下方法:首先制備三種金屬的金屬片樣本,金屬片直徑為1cm厚度為1mm的圓形,超聲清潔消毒后備用,首先進(jìn)行MC63細(xì)胞的傳代擴(kuò)增。待細(xì)胞達(dá)到所需數(shù)量后,將細(xì)胞以4×104/ml接種與金屬片上,每個金屬片1ml,利用表面張力使液體不外流,在培養(yǎng)的第12

14、小時,分別取出3組金屬片,用PBS輕輕沖洗表面,去除未貼壁細(xì)胞,加入0.25％的胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來,收集后細(xì)胞計數(shù),計算12小時的細(xì)胞貼壁率,并且相互比較。在培養(yǎng)的1,3,5,天,分別取三組金屬片的細(xì)胞按照實驗1的方法進(jìn)行MTT,堿性磷酸酶檢測,并在金相纖維鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。以上實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件,配對t檢驗,p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：實驗一的結(jié)果為,在1天時,兩組間的MTT檢測,AL

15、P活性檢測,VonKossa染色,無明顯區(qū)別,在第3天時,ALP活性檢測,VonKossa染色依然沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而MTT檢測顯示細(xì)胞增值有統(tǒng)計學(xué)差異。在5、7天時,所有檢測均有統(tǒng)計學(xué)差異。掃描電鏡在第7天顯示兩組細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。在金屬鈦表面實驗部分結(jié)果為在接種基質(zhì)干細(xì)胞24h后,兩組鈦表面的細(xì)胞粘附率有統(tǒng)計學(xué)差異,磁場組的粘附率要高于非磁場組。在第七天時,堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示磁場組的陽性率要高于非磁場組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。掃描電

16、鏡可見磁場顯著改變了基質(zhì)干細(xì)胞的表面形態(tài),細(xì)胞被拉長。實驗二部分的結(jié)果為在12小時,三組細(xì)胞的貼壁率無統(tǒng)計學(xué)差異。關(guān)于堿性磷酸酶檢測,在第一天時,三種金屬無統(tǒng)計學(xué)差異,在第三天和第五天時,無鎳不銹鋼的堿性磷酸酶的活性要高于另外兩種金屬。細(xì)胞的MTT檢測顯示在第一天時,三種金屬無統(tǒng)計學(xué)差異,在第三天和第五天時,無鎳不銹鋼的細(xì)胞增值要高于另外兩種金屬。
　　 結(jié)論：0.2T的恒定磁場可以顯著增強(qiáng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外和金屬鈦表面向成骨