骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨分化研究.pdf

1、目的：探討自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植在股骨頭缺損壞死部位，移植的骨髓細(xì)胞能否成活，能否停留在骨壞死、缺損部位生長增殖，能否分化為成骨細(xì)胞，及能否促進(jìn)成骨、修復(fù)股骨頭缺損壞死。 方法：試驗分三部分。①抽取雙側(cè)狗髂骨骨髓。骨髓細(xì)胞行貼壁細(xì)胞分離法分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，試驗用第二代細(xì)胞。移植前，用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記BMSCs。在狗雙側(cè)股骨頭后外側(cè)軟骨面近頭頸交界處，用直徑8mm的環(huán)鉆向股骨頭

2、中心方向鉆孔10mm深度，造成股骨頭直徑8mm、深度10mm的骨缺損模型。環(huán)鉆取出的骨質(zhì)經(jīng)微波滅活后，與標(biāo)記的BMSCs復(fù)合，植入一側(cè)自體股骨頭缺損處，另一側(cè)單純植入微波滅活骨作為對照，術(shù)后5周取材。②抽取雙側(cè)髂骨骨髓，行密度梯度離心法分離BMSCs，用熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記BMSCs，用明膠海綿吸附分離出的BMSCs，植入一側(cè)自體股骨頭缺損處，另一側(cè)單純植入明膠海綿作為對照，術(shù)后3周取材。③將體外培養(yǎng)擴(kuò)

3、增的BMSCs，與脫抗原小牛松質(zhì)骨復(fù)合植入一側(cè)自體股骨頭缺損處，另一側(cè)單純植入脫抗原小牛松質(zhì)骨作為對照，術(shù)后12周取材。利用激光共聚焦顯微鏡和免疫組織化學(xué)法分別觀察CFSE和Brdu的標(biāo)記和體內(nèi)定位情況。行X射線片，大體組織觀察，組織化學(xué)染色，圖像分析，及通過免疫組織化學(xué)方法和熒光免疫組織化學(xué)方法檢測成骨細(xì)胞特異性分化標(biāo)記核心結(jié)合因子al(Cbfal)、骨鈣素、骨橋素和I型膠原，以了解BMSCs體內(nèi)分化狀況和成骨效果。 結(jié)果：大

4、體組織學(xué)觀察顯示，BMSCs移植側(cè)骨缺損成骨程度明顯強(qiáng)于對照側(cè)。顯微組織學(xué)研究的結(jié)果進(jìn)一步顯示，BMSCs移植側(cè)骨缺損區(qū)內(nèi)的成骨量、骨基質(zhì)礦化的程度、骨成熟度明顯高于對照側(cè)，含有更加豐富的梭形間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分化特異性標(biāo)記Cbfal、骨鈣素、骨橋素、I型膠原表達(dá)也明顯強(qiáng)于對照側(cè)。股骨頭缺損內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量BrdU陽性細(xì)胞，新骨形成越活躍的地方，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目越多，很多成骨細(xì)胞BrdU陽性，新骨形成區(qū)的很多血管壁也分布著Br

5、dU陽性細(xì)胞。 熒光顯微鏡下觀察，見BMSCs移植側(cè)帶有CFSE綠色熒光的細(xì)胞定位于骨缺損內(nèi)，與抗-RunX2、Osteocalcin、Osteopontin-抗反應(yīng)的二抗(帶羅丹明標(biāo)記)在綠色熒光集中的地方也集中發(fā)出紅色熒光。結(jié)論：移植的骨髓細(xì)胞在股骨頭內(nèi)能成活，并能停留在骨缺損部位生長增殖。移植的BMSCs能分化成為多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及血管壁細(xì)胞等。BMSCs能分化成成骨細(xì)胞參與成骨，也能參與血管形成。移植的B