骨髓基質(zhì)干細胞的成骨示蹤研究.pdf

1、研究背景及目的：股骨頭壞死(osteonecrosis of femur head，ONFH)是臨床上較為常見的難治性疾病之一，多數(shù)進展至股骨頭塌陷從而繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，多數(shù)需行人工關(guān)節(jié)置換。目前ONFH的早期治療的重點在于保存股骨頭，防止塌陷。股骨頭的保存治療方法很多，但都有各自的優(yōu)缺點。近年來，骨髓基質(zhì)細胞(marrow stromal cells，MSCs)移植作為一種新的治療方法，也用于治療ONFH。MSCs移植后在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸與作用

2、機制是目前研究的熱點。為監(jiān)測活體內(nèi)移植細胞的分布、增殖、遷移等，傳統(tǒng)方法都需要在離體狀態(tài)下進行組織學檢查，難以準確地觀察植入細胞的生長分化情況，無法對干細胞移植的療效做出客觀評價，從而極大的阻礙了干細胞移植在臨床應(yīng)用上的發(fā)展。隨著分子生物學的發(fā)展和分子影像學概念的產(chǎn)生，人類開始能夠在細胞分子水平評價活體組織細胞的生物學過程。如利用MRI來監(jiān)測移植細胞，其最大的優(yōu)點是能夠無創(chuàng)地進行多次重復(fù)檢測。為能在MRI上區(qū)分移植細胞和靶組織細胞，需要

3、對移植細胞進行移植前標記。目前廣泛使用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)標記移植細胞。SPIO是一種納米級粒子，由于其特殊的化學結(jié)構(gòu)，SPIO即使在較弱的磁場中也可以產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場撤消后磁性也迅速消失，即具有所謂的超順磁性，可以使MRI的靶區(qū)信號均明顯降低，產(chǎn)生負性對比劑的效應(yīng)，從而經(jīng)SPIO標記的移植細胞團也就可因含SPIO顆粒而顯示為低信號，這樣就間接反映了移植細胞的分布和

4、聚集情況。目前應(yīng)用SPIO進行細胞的體內(nèi)示蹤主要應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)研究，在骨骼系統(tǒng)中的應(yīng)用鮮有報道。本實驗采用SPIO進行標記細胞的體外實驗及模擬股骨頭壞死區(qū)移植細胞的體內(nèi)示蹤，旨在明確SPIO體外標記狗骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的適當條件，以及經(jīng)MRI體外成像的特征和可成像的最低標記細胞量等；利用MRI進行移植細胞的示蹤，結(jié)合組織學觀察移植細胞在股骨頭內(nèi)的存活及轉(zhuǎn)歸；探討骨髓基質(zhì)干細胞的成骨及促進股骨頭壞死修復(fù)的能力。從而為

5、細胞移植的轉(zhuǎn)歸與作用機制研究打下工作基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用骨髓基質(zhì)細胞治療骨壞死找到一定的理論依據(jù)。 實驗方法：試驗分兩部分。 ①超順磁性納米氧化鐵顆粒(SPIO)體外標記MSCs：抽取狗的雙側(cè)髂骨骨髓，行梯度離心及貼壁細胞分離法分離骨髓基質(zhì)干細胞(MSCs)，進行體外培養(yǎng)擴增。按不同SPIO濃度設(shè)定實驗組，觀察不同實驗組之間標記率的差異性、對細胞增殖活性的影響、MRI成像的特征和條件等，找到合適的標記條件。觀察標記后細胞的遠

6、期增殖情況以及SPIO在細胞內(nèi)的存留穩(wěn)定性。 ②細胞的股骨頭壞死區(qū)內(nèi)移植及示蹤：制備股骨頭壞死模型。同時抽取狗雙側(cè)髂骨骨髓，行梯度離心及貼壁細胞分離法分離MSCs，進行體外培養(yǎng)擴增。2周后，骨壞死區(qū)病灶刮除，將體外標記了SPIO的MSCs與脫抗原小牛松質(zhì)骨復(fù)合，植入骨壞死區(qū)，另一側(cè)單純植入脫抗原小牛松質(zhì)骨作為對照，術(shù)后定期行活體MRI檢測，觀察不同時間段SPIO的體內(nèi)成像特點，并取材行組織學對照。利用顯微鏡、組織化學法及透射電鏡

7、等觀察SPIO的體外標記情況。行普魯士藍染色觀察含鐵顆粒的細胞在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)歸等情況。行HE染色及圖像分析，觀察MSCs在體內(nèi)的成骨效果。 實驗結(jié)果： ①SPIO可以很好的標記MSCs，并長期存留，適當濃度下對細胞活性無影響，一定數(shù)量時體外可被MRI所檢測。 ②SPIO標記細胞體內(nèi)移植側(cè)MRI檢測可見明顯低密度灶，3個月仍然可被檢測到。 ③股骨頭缺損內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量SPIO陽性細胞，新骨形成越活躍的地方，SP