β-葡聚糖酶的定向進化及熱穩(wěn)定性研究.pdf

1、β-葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在釀造和飼料工業(yè)中產(chǎn)生的負面影響。與國外相比，我國對β-葡聚糖酶的研究起步較晚，且研制的β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性普遍較差，不能滿足現(xiàn)代啤酒糖化工藝和顆粒飼料造粒的溫度要求，因此提高β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性具有非常重要的意義。本課題以大腸桿菌表達系統(tǒng)克隆和重組表達了β-葡聚糖酶基因；建立了高通量篩選耐熱β-葡聚糖酶的方法；以克隆的β-葡聚糖酶基因為起始材料，通過設計的定向進化策略和建立的篩

2、選手段提高野生型β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性；檢驗所構建的熱穩(wěn)定性重組菌株的遺傳穩(wěn)定性；對熱穩(wěn)定性突變株EGs2的發(fā)酵條件進行優(yōu)化；篩選并優(yōu)化出提高β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的復合保護劑；估算了熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的儲藏壽命。主要研究結果如下：從BacillussubtilisZJF-1A5中克隆了大小為849bp的β-葡聚糖酶基因。通過序列比對，該基因編碼的氨基酸序列與BorrissR、Sun，J和Hidetoshi發(fā)表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列

3、分別有1-3氨基酸的替換。β-葡聚糖酶基因經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切后與用同樣限制性內(nèi)切酶切割的載體pET28a(+)進行重組表達，得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。對酶在宿主細胞中的位置進行測定，結果顯示：β-葡聚糖酶不僅分泌至細胞外，而且也存在于細胞內(nèi)和周質(zhì)空間。發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸氨鹽析沉淀和DEAECellulose52離子交換柱層析，純化的β-葡聚糖酶經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，純化產(chǎn)品為單一條帶，分子量約27KD。純化的

4、β-葡聚糖酶的熱學性質(zhì)研究表明：β-葡聚糖酶的Tm值為62.5℃，最適反應溫度為55℃。 本研究將定位膜轉(zhuǎn)印和肉眼可見的平板篩選策略相結合，通過對影響菌落生長、酶的表達和轉(zhuǎn)印成功率的各因素的優(yōu)化，建立了高通量篩選耐高溫β-葡聚糖酶的方法。結果顯示：每個LB平板(直徑90mm)用4μl200mg/mlIPTG；IPTG要預先涂在LB平板上；菌落密度約為100個/平板；菌落培養(yǎng)時間為37℃，15小時；完全鈍化野生型酶的條件為100℃

5、2小時。對該方法的穩(wěn)定性考察結果顯示：該方法的重現(xiàn)性為100％，假陽性率為0.16％，假陰性率為12.22％。與其它高通量篩選方法相比，以濾膜為基礎的高通量篩選方法存在許多優(yōu)點，如透明圈清晰，假陽性率較低，篩選通量高，操作簡便，費用低等。該方法作為一種固相酶篩選方法，在鑒別熱穩(wěn)定性和低溫下催化活性同時得到提高的變異體時非常有效。 為了提高β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，利用體外定向進化技術對編碼β-葡聚糖酶的基因進行改造。設計的定向進化

6、策略包括一輪的隨機突變和一輪的DNA改組。應用建立的高通量篩選方法篩選熱穩(wěn)定性突變體，最終獲得EGs1和EGs2兩株熱穩(wěn)定性突變體。通過對野生酶和突變酶的DNA序列和酶學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)：EGs1和EGs2分別有四個和五個氨基酸替換；這些氨基酸替換使EGs1和EGs2突變酶的Tm值分別比野生酶的Tm值(62.5℃)提高了3℃和5℃，達到了65.5℃和67.5℃；突變酶的最適反應溫度也提高了5℃；兩個突變酶對地衣多糖的水解能力分別被提高28％

7、和降低21.6％；對地衣多糖的親和力與野生型的一致，未見改變；在酶的最適pH值上，野生酶和EGs1突變酶為6.5，而EGs2突變酶為7.0；在酶的pH值穩(wěn)定性方面，野生型和突變型β-葡聚糖酶都有較寬的pH穩(wěn)定范圍，在pH6.0-8.5的范圍內(nèi)放置48h，β-葡聚糖酶仍保持80％以上的酶活力。這一結果說明了定向進化在提高酶的熱穩(wěn)定性方面是比較有效的。 遺傳穩(wěn)定性檢驗結果表明：EGs1和EGs2突變株傳代50次后，質(zhì)粒穩(wěn)定性良好，重

8、組表達的目的產(chǎn)物活性保持恒定，說明突變株的遺傳穩(wěn)定性良好。 通過搖瓶發(fā)酵分析，突變株EGs2最佳生長條件為：裝液量40ml，接種量1.5％，初始pH值為6.5-7.0。在此條件下，菌體生長6小時后進入穩(wěn)定期。分別用IPTG和乳糖作為誘導劑，對適于菌體生長和目的產(chǎn)物表達的條件進行優(yōu)化，結果顯示：IPTG和乳糖都可以作為重組工程菌的誘導劑；乳糖的誘導效果稍好于IPTG的誘導效果；IPTG濃度對菌體生物量和目的產(chǎn)物表達量影響不大，而乳

9、糖濃度對菌體生物量和目的產(chǎn)物表達量的影響較大。溫度對目的產(chǎn)物在上清液中的積累影響較大，對菌體生物量的影響不大。合適的IPTG誘導條件為：誘導時間，4小時；誘導劑濃度，0.1mmol/L；誘導溫度，34℃。合適的乳糖誘導條件為：誘導時間，4小時；誘導劑濃度，10mmol/L；誘導溫度，32℃。 通過單因素實驗，篩選出能提高β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的保護劑，并設計正交實驗優(yōu)化復合保護劑組成。結果表明白蛋白，明膠和CaCl2.2H2O都能

10、明顯提高β-葡聚糖酶的穩(wěn)定性；復合保護劑配方為：0.8％(w/v)白蛋白，2％(w/v)明膠，1mmol/LCaCl2.2H2O。含保護劑的β-葡聚糖酶的Tm值比不含保護劑的酶的Tm值高4℃，加保護劑和未加保護劑的酶液在36.2℃下的熱降解速度分別為-0.0398和-0.084，這說明保護劑對酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性都起到了較好的保護作用。 利用加速實驗估算了β-葡聚糖酶在不同溫度下的儲存壽命。選擇的實驗溫度為28℃，36.2℃

11、，45℃。將盛有β-葡聚糖酶的樣品瓶放入不同溫度的水浴中，不同時間取樣并測定β-葡聚糖酶活性。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理結果得出：β-葡聚糖酶在45℃，36.2℃和28℃活性損失10％所需時間為1.36d，4.37d和20.09d?；钚該p失50％所需時間為8.5d，25.47d，104.9d。由壽命估算曲線估算出β-葡聚糖酶在25℃,20℃，15℃，4℃和0℃時，活性損失10％需要的時間分別為30.7d，67.0d，145.9d，2.21年，4